Chemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Analyseren van platforms voor eiwit en eiwit-Ligand complexen door integratieve structurele massaspectrometrie
Summary October 15th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
De Spectrometrie van de massa (MS) heeft ontpopt als een belangrijk instrument voor het onderzoek naar de structuur en de dynamiek van macromoleculaire assemblages. Hier, wij op basis van MS om te ondervragen eiwit complexvorming en ligand bindende benaderingen worden geïntegreerd.
Transcript
Tegenwoordig speelt massaspectrometrie een belangrijke rol in de structurele biologie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over belangrijke biologische macromoleculen in hun eigen staat, met name eiwitten en eiwitcomplexen. Inheemse massaspectrometrie is op grote schaal van toepassing op een verscheidenheid van biomoleculaire assemblages, waaronder multiproteïne en nucleïnezuursystemen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het snel en zeer gevoelig is. Het kan worden gebruikt om heterogene eiwitmonsters te ondervragen, het mogelijk maken om meerdere eiwitten in oligomerische toestand tegelijkertijd te analyseren. Het demonstreren van de procedure zal Andy Lau, een promovendus in mijn groep.
Om deze procedure te beginnen, bereidt u de interne haarvaten voor nanoelekrospray zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid een ligand-vrij monster als een controle voor elke run als buffer uitwisseling elk in ammonium acetaat. Selecteer vervolgens de tof-modi gevoeligheid, positieve ionenverwerving en mobiliteits- en mobiliteits-TOF.
Schakel vervolgens de trap-, API- en IMS-gassen in. Voor IM scheiding gebruik maken van de stikstof en argon uitgangspunten hier getoond en aan te passen als dat nodig is. Stel een geschikte m/z acquisitiereeks in.
Voor een onbekend eiwit moeten de eerste optimalisatiestappen een breed bereik gebruiken. Steek de met goud bedekte capillaire in een capillaire houder. Laad vervolgens tussen twee en drie microliters van de eiwitcomplexe oplossing van belang in de capillaire.
Draai de capillaire aan en plaats deze op het elektrospraybronpodium. Schuif de fase in positie om gegevens te verzamelen. Breng een lage nanostroom gasdruk tot een druppel vormen aan het puntje van de capillaire.
Verplaats de capillaire ten opzichte van de kegel en controleer de ionenstroom om een stabiele ionenstroom te bereiken. Breng een capillaire spanning aan in het bereik tussen 0,9 en 1,6 kilovolt. Stel vervolgens de bemonsteringskegel, bronverschuiving, brontemperatuur en kegelgasstroom in zoals beschreven in het tekstprotocol.
Om een goed opgelost massaspectrum en gemaximaliseerde ionentransmissie te verkrijgen, past u de MS-parameters aan en controleert u de resulterende verandering in de spectra. Stel de val botsing energie op een eerste startpunt tussen 10 en 50 volt. Als de spanningsverschuivingen onvoldoende zijn, past u de valbotsingsenergie aan.
Stel de val via de spanning op een eerste startpunt tussen 20 en 45 volt. Verbeter desolvation door het optimaliseren van deze spanning. Optimaliseer hierna de golfsnelheid en golfhoogte zoals beschreven in de tekst om de beste mobiliteitsscheiding te bereiken.
Voor studies waarbij HerA en NurA gebruik maken van een golfsnelheid van 40 meter per seconde en een golfhoogte tussen 550 en 650 volt. Voor DNA-bindingsanalyse, meng het eiwit en DNA op een kiesverhouding die het mogelijk maakt voor eiwit DNA complexe vorming. Voeg steeds meer van een van de volgende, 5'O-3-thio-triphosfate, tetralithium zout, of ADP.
Met behulp van geschikte software meet de massa's van gegenereerde soorten en identificeren van de ligand binding, zoals ATP en ADP binding en oligomeric staten. Gebruik vervolgens de ionenintensiteiten die in de ruwe ESI MS-spectra worden waargenomen om de overeenkomstige relatieve overvloed aan soorten te kwantificeren. Na het optimaliseren van de instrumentomstandigheden voor een stabiele transmissie, vermindert u de botsingsenergie en bemonsteringskegel zo laag mogelijk, met behoud van een goede spectrakwaliteit.
Gebruik de eerder bepaalde geoptimaliseerde golfsnelheid en golfhoogte om IM MS te verkrijgen. Meet de ionendrifttijd bij drie verschillende golfsnelheden met behoud van dezelfde golfhoogte. Om het eiwition TE bepalen meet CCS vier eiwitkalibbrants, twee met de massa boven het onderzochte eiwit en twee met de massa hieronder, met dezelfde instrumentatievoorwaarden. Bereid eerst de eiwitmonsters voor en buffer wissel ze uit in ammoniumacetaat zoals beschreven in het tekstprotocol.
Voeg oplosmiddel in stappen van 10%tot het bereiken van de gewenste hoeveelheid. Een uur lang incubeer op ijs. Hierna een IM-MS-spectrum voor elk monster.
Wijs met behulp van de SUMMIT-software eiwitsubcomplexen toe en genereer eiwitinteractienetwerken. U ook handmatig een lijst van theoretische massa's genereren voor de verwachte soorten. Om te beginnen met het onderzoeken van eiwitcomplexe stabiliteit, registreert u IM-MS-gegevens en verhoogt u de spanning van de valversnelling van 10 volt naar 200 volt, die zich geleidelijk zal ontvouwen tot het eiwit en de gasfase.
Analyseer de gegevens met behulp van de juiste software en genereer tweedimensionale ontvouwingspercelen door de intensiteit genormaliseerde CCS-distributies te stapelen bij elke versnellingsspanning voor elke laadstatus. Native MS-resultaten onthullen de oligomerische toestand, samenstelling en topologie van het HerA- en NurA-complex. Aangezien niet-covalente interacties in de gasfase behouden blijven, worden inheemse MS van ATP gamma S en ADP titratieexperimenten gebruikt om de paarswijze nucleotidebinding in de HerA en NurA te bepalen.
Massaspectra van de HerA oligomeric staten blijkt dat het verhogen van de ATP gamma S concentratie verhoogt de relatieve intensiteit van hexamerische HerA. De experimentele CCS-waarden voor de eiwitten en hun complexen worden vervolgens afgeleid uit de IM-MS experimenten. Deze waarden worden gezien als een goede overeenkomst met theoretische metingen van x-ray kristallografie, die valideert met behulp van CCS waarden voor het bouwen van lage resolutie modellen van eiwit assemblage.
CIU en KEcom analyse blijkt dat DNA gebonden HerA-NurA is stabieler dan de DNA-vrije complex. CIU MS-analyse en de respectieve ATP-bindingstoestanden tonen aan dat de vier ATP-gamma S-gebonden toestand de complexe stabiliteit in de gasfase vermindert. Echter, de zes ATP gamma S gebonden staat waarin alle sites bezet zijn, wordt gezien als de meest stabiele.
Nauwkeurige metingen van de moleculaire massa van een intact complex geven waardevol inzicht in biomoleculaire karakterisering. We kunnen informatie krijgen over complexe assemblagetrajecten, eiwit oligomerisatie en ligand binding. Het combineren van al deze informatie maakt het mogelijk om gedetailleerde modellen van functionele biologische samenstellingen te genereren.
Related Videos
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE