Bioengineering
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जैव भौतिक हड्डी पुनर्जनन के लिए सामग्री पर संगतता प्रोफ़ाइल
Summary November 16th, 2018
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बड़े हड्डी घावों की मरंमत के लिए इंजीनियर के उपंयास की संख्या लगातार हड्डी चिकित्सा बढ़ाने और अस्थि प्रत्यारोपण के साथ जुड़े जटिलताओं को दूर करने के उद्देश्य के साथ विस्तार हो रहा है । यहां, हम अस्थि की मरंमत के लिए पूर्व नैदानिक के लिए एक multidisciplinary रणनीति के साथ-साथ गैर-चिकित्सीय असंगति परीक्षण प्रस्तुत करता है ।
Transcript
इन तरीकों से बायोमैटेरियल्स के क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद मिल सकती है। विशेष रूप से अस्थि उत्थान के लिए। वे बायोमैटेरियल्स और संभावित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किए जाते हैं।
इस बहुविषयक मंच का मुख्य लाभ यह है कि यह हड्डी की मरम्मत के लिए उपयोग किए जाने वाले बायोमैटेरियल्स की जैव अनुकूलता की भविष्यवाणी करने के लिए कई मापदंड प्रदान करता है। इन इन विट्रो और वीवो हड्डी तकनीकों में निहितार्थ अन्य अस्थि विकारों की ओर विस्तार करते हैं। उपन्यास आर्थोपेडिक बायोमैटेरियल्स की प्रीक्लिनिकल स्क्रीनिंग की आवश्यकता के कारण।
त्वचा संबंधी पद्धति हड्डी उपचार के लिए बायोमैटेरियल्स में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, इसे किसी अन्य नैदानिक संकेत के लिए बायोमैटेरियल आकलन पर भी लागू किया जा सकता है। ऑस्टियोजेनिक मिनरलाइजेशन माध्यम के अलावा 14 दिनों के बाद प्राथमिक ऑस्टियोब्लास्ट से एस्पिरेट संस्कृति माध्यम। 1X PBS के 0.5 मिलीलीटर के साथ दो बार कुल्ला।
फिर 10% बफर फॉर्मेलिन समाधान के 0.5 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेटिंग करें। 10 मिनट के बाद, एक उपयोग पाइप के साथ 10% बफर फॉर्मेलिन को एस्पिरेट करें और 0.5 मिलीलीटर अल्ट्रापुरे पानी के साथ दो बार धोएं। इसके बाद फिक्स्ड ऑस्टियोब्लास्ट में 40 मिलीमोलर अलीजारिन रेड एस स्टेनिंग सॉल्यूशन के 250 माइक्रोलीटर डालें।
और 100 पर एक शेखर पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली इनक्यूबेट प्रति मिनट हिलाता है। धुंधला समाधान के साथ इनक्यूबेशन के बाद, एक एकल उपयोग पिपेट के साथ धुंधला समाधान को एस्पिरेट करें और अल्ट्रापुरे पानी के एक मिलीलीटर के साथ कुल्ला करें। इस चरण को पांच से 10 बार दोहराएं जब तक कि कुल्ला समाधान गैर-विशिष्ट धुंधला को हटाने के लिए स्पष्ट नहीं हो जाता है।
अंतिम धोने के बाद, ठंड पीबीएस के एक मिलीलीटर जोड़ें । और पहले की तरह एक शेखर पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली इनक्यूबेट । इसके बाद, दाग बीटा ट्राइकैल्सियम फॉस्फेट डिस्क को एक नए कुएं में स्थानांतरित करें और खनिजीकरण को रिकॉर्ड करने के लिए प्लेटों को फ्लैटबेड स्कैनर के साथ स्कैन करें।
छवि कैप्चर के बाद, 10% सीटाइलपीरिडिनियम क्लोराइड समाधान के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें और अलीज़ारिन रेड एस डाई निकालने के लिए 15 मिनट तक हिलाएं। इसके बाद, कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 17, 000 x g पर कुओं से समाधान को व्यक्तिगत 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और सेंट्रलाइज में स्थानांतरित करें। 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 1:10 से 1:20 के कमजोर पड़ने वाले राशन पर 10% सेटाइपिरिनियम क्लोराइड समाधान के साथ निकालने को पतला करें।
फिर प्रत्येक पतला नमूना के 300 माइक्रोलीटर को 96-वेल प्लेट के कुओं में स्थानांतरित करें। केवल 10% सीटाइल्पाइडिनियम क्लोराइड युक्त दो खाली कुओं को शामिल करें। इसके बाद, एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए 10% सीटाइलपीरिडिनियम क्लोराइड समाधान के साथ 40 मिलियन माइक्रोमोलर से लेकर सात अलीजारिन रेड एस संदर्भ मानक तैयार करें।
प्लेट में प्रत्येक मानक के 300 माइक्रोलीटर लोड करें। अंत में, 520 नैनोमीटर पर नमूनों, रिक्त स्थान और संदर्भ मानकों के शोषक पढ़ें। कूल्हे के जोड़ में शरीर से पैरों को हटाने के लिए बाँझ कैंची का उपयोग करके एक इच्छामृत्यु दार और एक इच्छामृत्यु माउस के टिबिया से बोन मैरो ऑस्टियोप्लास्ट अग्रदूत को अलग करें।
घुटने और टखने के जोड़ों पर अंगों को काटें और बाँझ स्केलपेल और संदंश के साथ नरम ऊतक को हटा दें। एपिफिसिस काट लें। ल्यूमेन में हड्डी विकास माध्यम के एक मिलीलीटर से भरी सिरिंज से जुड़ी 27 गेज सुई डालें और मैरो को छह सेंटीमीटर बाँझ पेट्री डिश में फ्लश करें।
सभी फीमर और टिबिया के लिए इसे दोहराने के बाद, सेल निलंबन को 50 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें। छह सेंटीमीटर पेट्री डिश को पांच मिलीलीटर बोन ग्रोथ मीडियम से धोएं और इसे उसी 50 मिलीलीटर शंकु नली में ट्रांसफर करें। पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर ३५० एक्स जी पर सेंट्रलाइज ।
अपकेंद्रित्र के बाद ऑस्टियोक्लास्ट विभेदन माध्यम के प्रति अच्छी तरह से एक मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। एक BALB/c माउस १ २४-अच्छी संस्कृति प्लेट के लिए ऑस्टियोप्लास्ट अग्रदूतों की पर्याप्त संख्या प्रदान करता है । बायोमटेरियल पर हड्डी के विकास माध्यम में निलंबित प्राथमिक ऑस्टियोब्लास्ट जोड़ें और 8.8 * 10 ^ 4 कोशिकाओं प्रति वर्ग सेंटीमीटर पर नियंत्रण।
बीटा ट्राइकैल्सियम फॉस्फेट डिस्क, नियंत्रित गोजातीय हड्डी, और ऊतक संस्कृति प्लास्टिक का उपयोग यहां किया जाता है। 24 घंटे के लिए पांच प्रतिशत कार्बन डाइऑक्साइड में ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । 24 घंटे के बाद, सुसंस्कृत प्राथमिक ऑस्टियोब्लास्ट के लिए हौसले से अलग बोन मैरो ऑस्टियोक्लास्ट प्रीकर्टर्स और ऑस्टियोक्लास्ट विभेदन माध्यम जोड़ें और पांच प्रतिशत कार्बन डाइऑक्साइड पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति के पांच दिनों के लिए इनक्यूबेटर में लौटें ।
हर दूसरे दिन ताजा तैयार ऑस्टियोक्लास्ट विभेदन माध्यम के साथ माध्यम की जगह । फिर भेदभाव का मूल्यांकन करने के लिए टार्ट्रेट प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट के लिए ऑस्टियोक्लास्ट दाग। एक एनेस्थेटाइज्ड आठ सप्ताह पुराने BALB/c माउस की खोपड़ी दाढ़ी और ७.५% povidone आयोडीन समाधान और ७०% इथेनॉल के साथ सतह को साफ ।
प्रक्रिया के दौरान सूखने से रोकने के लिए नेत्र मरहम के साथ आंखों को कवर करें। एक अंगुली और पूंछ चुटकी के लिए एक प्रतिक्रिया की कमी से संज्ञाहरण का एक उपयुक्त स्तर सुनिश्चित करें। फिर एक मिडलाइन सैगिटल चीरा बनाने के बाद इसे स्केलपेल के साथ स्क्रैप करके सही पैरीटल हड्डी के ऊपर पैराकनियम कनेक्टिव ऊतकों को हटा दें।
फिर सही पैरीटल हड्डी में एक महत्वपूर्ण आकार का दोष बनाने के लिए प्रति मिनट 2000 घूर्णन पर चार मिलीमीटर के व्यास के साथ एक बाँझ दंत ट्रेफिन का उपयोग करें। लगातार सही पार्श्व हड्डी को निशाना बनाकर और एक्टोकॉर्टेक्स और कुछ एंडोकोरटेक्स के माध्यम से काटने के दौरान बाँझ खारा समाधान के साथ क्षेत्र की सिंचाई करें। डेरा मेटर को नुकसान से रोकने के लिए, शेष एंडोकोरेक्स के माध्यम से तोड़ने के लिए एक छोटे पेरिओस्टियल लिफ्ट का उपयोग करें।
फिर कैल्वेरिकल बोन को ध्यान से उठाने और उसे हटाने के लिए संदंश का प्रयोग करें। परिणामी दोष गोलाकार और व्यास में लगभग 3.5 मिलीमीटर होना चाहिए। इसके बाद, बाँझ पीबीएस में प्रीसोक्ड बीटा ट्राइस्केलियम फॉस्फेट कोलेजन फोम के साथ कैल्व्रियल दोष भरें।
बायोमटेरियल को जगह में रखने के लिए, दोष के अंत में दो विपरीत बिंदुओं पर ऊतक चिपकने के 0.5 माइक्रोलीटर लागू करें। फिर त्वचा को एक गैर-गैर-आबबूल सीवन के साथ बंद करें। अपनी पीठ पर एक एनेस्थेटाइज्ड माउस रखें, पेट के फर को शेव करें और 7.5% पोविडोन आयोडीन समाधान और 70% इथेनॉल के साथ मुंडा सतह को साफ करें।
पेट की लाइना अल्बा के साथ त्वचा के माध्यम से आठ मिलीमीटर लंबी मिडलाइन चीरा बनाने के बाद, प्रत्यारोपण पीबीएस त्वचा के नीचे बायोमटेरियल भिगोया। फिर त्वचा को एक गैर-आबचनीय सीवन के साथ सीवन करें। आठ सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण, इच्छामृत्यु माउस से आसपास के ऊतकों के साथ प्रत्यारोपण साइट आबकारी ।
यह छवि दर्शाती है कि खुले सलाखों में दिखाए गए बीटा ट्राइकैल्सियम फॉस्फेट डिस्क पर वृद्धि सात और 14 दिनों की संस्कृति में ऊतक संस्कृति प्लास्टिक पर वृद्धि की तुलना में ऑस्टियोब्लास्ट व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करती है। सुसंस्कृत ऑस्टियोब्लास्ट को 14 दिनों के बाद अलीजारिन रेड एस से दाग दिया गया था। खनिजीकरण मध्यम नियंत्रण के लिए अधिक था, जबकि केवल मध्यम में सुसंस्कृत ऑस्टियोब्लास्ट की तुलना में खनिजीकरण मध्यम नियंत्रण के लिए अधिक था।
और निलंबन संस्कृति कुओं में बीटा ट्राइकैल्सियम फॉस्फेट डिस्क पर। जब एक शल्य चिकित्सा प्रेरित महत्वपूर्ण आकार के कैल्वरियल दोष को खाली छोड़ दिया गया था, तो पूरे दोष को कवर करने वाली एक पतली परत देखी गई, लेकिन ऑपरेशन के बाद 12 सप्ताह में कोई महत्वपूर्ण हड्डी निर्माण मौजूद नहीं था। इसके विपरीत, जब दोष बीटा ट्राइकैल्सियम फॉस्फेट कोलेजन फोम निहित है, फोम अवशेष कुछ रक्त वाहिकाओं और भड़काऊ कोशिकाओं सहित घने रेशेदार ऊतक से घिरा हड्डी गठन के सबूत के बिना दोष क्षेत्र पुल ।
चमड़े के नीचे बीटा ट्राइस्केलियम फॉस्फेट कोलेजन फोम प्रत्यारोपण के बाद, विदेशी शरीर की विशाल कोशिकाओं के साथ एक भड़काऊ प्रतिक्रिया हेमटॉक्सीलिन और ईओसिन-दाग वर्गों पर आठ सप्ताह में मैसन के ट्राइक्रोम दाग वर्गों पर फाइब्रोसिस का सबूत देखा गया था। इसके विपरीत, नकली नियंत्रण के प्रत्यारोपण साइट में न्यूनतम सूजन और कोई फाइब्रोसिस नहीं था। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय जानवर को चोट पहुंचाए बिना कैल्व्रियम के सटीक और प्रजनन योग्य पायदान करना महत्वपूर्ण है।
इस प्रक्रिया के अन्य तरीकों जैसे ऑस्टियोक्लास्ट विभेदन परख और पेरिटोनियल प्रतिरक्षा मॉडल में उच्च थ्रूपुट के बाद बायोमैटेरियल्स और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रकार के लिए ऑस्टियोक्लास्ट की प्रतिक्रिया जैसे अतिरिक्त सवालों का जवाब देने के लिए प्रीफॉर्म किया जा सकता है।
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