心脏以动态方式对缺血（I）和再灌注（R）损伤作出反应。然而，目前对这一反应过程中蛋白质合成的急性变化仍缺乏深入了解。为解决这一问题，我们采用了已建立的多聚核糖体谱分析方法1，以鉴定反映核糖体和翻译调控因子从细胞质重新分布至多聚核糖体、以及新合成蛋白质（NSPs）增加所导致的蛋白质丰度变化。在缺血/再灌注（I/R）条件下，新蛋白质合成的增加发生在与新mRNA转录时间不一致的时间范围内2；此外，已有研究报道mRNA表达水平与蛋白质丰度之间存在不一致性3。基于这些原因，我们选择分析由蛋白质翻译所反映的动态蛋白质组的变化。为此，我们定量多聚核糖体组分中的mRNA，并分析多聚核糖体组分中的蛋白质组成。最后，由于微小RNA（miRs）可调控mRNA的翻译可用性，并可能干扰蛋白质翻译效率4,5，我们进一步检测了miRs在多聚核糖体组分中的分布情况，重点关注其对I/R的响应。
我们选择采用离体小鼠Langendorff灌流模型，在持续灌流的基础条件下、30分钟全心无血流缺血后，以及30分钟缺血再加30分钟再灌注后分别采集组织。随后将心脏组织溶解，并通过蔗糖梯度离心分离多聚核糖体，继而进行蛋白质组学分析，并分别通过PCR和微阵列技术选择性检测mRNA和miRNA。该方法组合为理解动态蛋白质组提供了一种强有力的手段，可同时检测mRNA、miRNA和新合成蛋白质（NSPs），并分析调控蛋白、miRNA和mRNA在非翻译组分、低效率多聚核糖体和高效率多聚核糖体之间的重新分布（见图1）。通过进一步分析关键调控因子（如eIF2α或mTOR）的磷酸化状态，可深入揭示该过程的动态调控机制。以下将详细描述各个实验步骤。
该方法有助于解答有关动态蛋白质合成及参与该过程的蛋白质组的关键问题。该技术能够鉴定出正在被选择进行翻译的mRNA、可参与并干扰翻译过程的microRNA，以及参与蛋白质翻译或自身正在被翻译的蛋白质。该方法可为心脏对压力刺激的响应提供深入见解，也可应用于其他器官对压力急性反应的研究。
演示该实验步骤的是来自 Jennifer Van Eyk 实验室的项目科学家 Miroslava Stastna。实验当天，将梯度混合器的左侧室加入 5 毫升 15% 蔗糖梯度溶液，右侧室加入 5 毫升 50% 蔗糖梯度溶液。打开活塞并启动泵，使用磁力搅拌器搅拌两个小室，并通过连接第二个活塞的管道，使混合后的蔗糖溶液流入置于冰上的薄壁超速离心管中。
接下来，将新鲜或冷冻的心脏组织在冰上用匀浆缓冲液中使用POLYTRON匀浆15秒。孵育结束后，离心裂解液以去除不溶性物质，并收集上清液。保留50微升上清液用于蛋白质定量、RNA提取及RNA完整性分析，将剩余上清液中的100至500微升小心铺加到梯度溶液上。
使用新鲜的裂解缓冲液平衡两个梯度管之间的体积，并将样品置于带有摆动桶转子的超速离心机中进行超速离心。在离心前和离心后均需格外小心，避免扰动蔗糖梯度。收集梯度时，设置馏分收集器在最初三分钟内弃去收集液，随后以每分钟1毫升的速度，在4至19分钟内连续收集17个馏分，同时连续监测254纳米处的吸光度，以分别获取重链、轻链及非翻译组分。
收集到每个组分后应立即置于冰上。若不能立即处理，需将样品储存在零下80摄氏度。为从多聚核糖体组分中提取蛋白质，将收集的蔗糖组分合并为三个最终组分，并将其标记为重链、轻链和非翻译组分。
将每份样品各取 0.5 毫升与 60 微升 100% 三氯乙酸（TCA）混合。将混合物于 -20 °C 避光孵育过夜。次日早晨，在冰上融化样品，然后通过离心沉淀蛋白质。
弃去上清液，再用 0.5 毫升预冷至负 20 摄氏度的丙酮洗涤沉淀物，每次离心后各洗涤一次，共洗涤两次。确保三氯乙酸（TCA）沉淀后的沉淀物完全溶解，必要时使用脉冲超声处理以保证完全溶解。最后一次洗涤后，将沉淀物在空气中干燥，然后重悬于 360 微升 Tris-HCl 缓冲液中。
然后加入 40 µL 二硫苏糖醇，在 55 °C 下振荡孵育 45 分钟。孵育结束后，在避光条件下，向样品中加入 50 µL 碘乙酰胺，在室温下于摇床上孵育 30 分钟，随后按照 1:50 的酶与蛋白质量比加入胰蛋白酶，于 37 °C 振荡过夜孵育。次日早晨，样品冷却后短暂离心，并用 10% 甲酸将 pH 调至 2 至 3，以终止胰蛋白酶活性。
为去除样品中的盐分，首先用 200 微升甲醇对 96 孔板中的各孔填料进行三次预处理，每次 200 微升；随后用每孔 200 微升的 0.1% 甲酸进行三次平衡。接着将样品加入各孔中，并用每孔 200 微升