Das Herz reagiert auf die Verletzung von (I) Ischämie und Reperfusion (R) in einer dynamischen Art und Weise. Allerdings gibt es wenig Einblick in akute Veränderungen bei der Proteinsynthese während der Reaktion. Um dieses Problem anzugehen, wir nutzten die etablierte Methode der Polysome Profilierung1 zur Identifizierung von Änderungen im Protein-Überfluss, die Umverteilung von Ribosomen und Translationale regulatorische Faktoren vom Zytosol zu Polysomes, zu reflektieren und die Anstieg der neu synthetisierten Proteine (NSP). In der Umgebung von I / R, die Zunahme der neuen Protein-Synthese erfolgt in einem Zeitrahmen, die nicht übereinstimmen mit Transkription des neuen mRNAs2; Darüber hinaus wurde Discordance zwischen mRNA Ausdruck und Protein Fülle gemeldeten3. Aus diesen Gründen haben wir die Änderungen in der dynamischen Proteomforschung zu analysieren, wie Protein Übersetzung widerspiegelt. Um dies zu tun, wir mRNA in den Polysome Fraktionen zu quantifizieren, und analysieren die Proteinzusammensetzung in den Polysome Fraktionen. Schließlich, da MicroRNAs (MiRs) Verfügbarkeit von mRNAs für die Übersetzung zu regulieren und Effizienz von Protein Übersetzung4,5stören können, untersuchten wir die Verteilung der MiRs in den Polysome Fraktionen, mit Schwerpunkt auf der Antwort auf I / r.

Wir entschieden uns für die isolierten Langendorff Perfusion Mausmodell und geernteten Gewebe unter basalen Bedingungen der kontinuierliche Perfusion, nach 30 min global keine-Flow-Ischämie und nach 30 min von Ischämie, gefolgt von 30 min der Reperfusion verwenden. Wir dann solubilisiert Herzgewebe und Polysomes über einen Saccharose Gradienten getrennt gefolgt von Proteomic Analysen und selektive Detektion von mRNAs und MiRNAs durch PCR und Microarray, beziehungsweise. Diese Kombination von Methoden steht einen leistungsfähigen Ansatz zum Verständnis der dynamischen Proteom, ermöglicht simultane Detektion von mRNA und MiRNA, Nadel-, sowie die Umverteilung von regulatorischen Proteinen, MiRNA und mRNA zwischen nontranslating Brüchen, niedrige Effizienz Polysomes und Hochleistungs-Polysomes (siehe Abbildung 1). Einblicke in die dynamische Regulierung dieses Prozesses werden durch weitere Analysen der Phosphorylierung wichtige regulatorische Faktoren wie eIF2α oder mTOR verlängert werden. Diese einzelnen Schritte sind nun detailliert beschrieben.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur dynamischen Proteinsynthese und dem daran beteiligten Proteom zu beantworten. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung der mRNAs, die für die Translation ausgewählt werden, der microRNAs, die am Prozess teilnehmen und die Translation stören können, und der Proteine, die zur Proteintranslation beitragen oder selbst translatiert werden. Diese Methode kann Einblicke in die kardialen Reaktionen auf Stress geben, kann aber auch auf die Untersuchung akuter Stressreaktionen in anderen Organen angewendet werden.

Das

Verfahren wird von Miroslava Stastna, einer Projektwissenschaftlerin aus dem Labor von Jennifer Van Eyk, vorgeführt. Füllen Sie am Tag des Experiments das linke Fach eines Gradientenmischers mit fünf Millilitern 15%iger Saccharose-Gradientenlösung und füllen Sie das rechte Fach mit fünf Millilitern 50%iger Saccharose-Gradientenlösung. Öffnen Sie den Hahn und schalten Sie die Pumpe ein, um die beiden kleinen Kammern mit einem Magnetrührer zu rühren, und verwenden Sie ein Rohr, das mit dem zweiten Hahn verbunden ist, damit die gemischten Saccharoselösungen in ein einzelnes Ultrazentrifugenröhrchen mit dünnen Wänden auf Eis fließen