Le cœur répond à la lésion d’ischémie (I) et de la reperfusion (R) de manière dynamique. Cependant, il y a petit aperçu des changements aigus dans la synthèse des protéines au cours de la réponse. Pour y remédier, nous avons profité de la méthode bien établie de polysome1 pour identifier les changements dans l’abondance des protéines qui reflètent la redistribution des ribosomes et des facteurs de régulation traductionnelle du cytosol aux polysomes, le profilage et le augmentation des protéines nouvellement synthétisées (NSP). Dans le cadre d’I / R, l’augmentation de la synthèse des protéines nouvelles se produit dans un laps de temps qui est incompatible avec la transcription de l’ARNm nouveau2; en outre, une discordance entre les niveaux d’expression de mRNA et l’abondance de la protéine a été rapporté3. Pour ces raisons, nous avons choisi d’analyser les changements dans le protéome dynamique comme en témoigne la traduction des protéines. Pour ce faire, nous quantifier des ARNm dans les fractions de polysome et d’analyser la composition en protéines dans les fractions de polysome. Enfin, parce que les microARN (miRs) réglemente la disponibilité d’ARNm pour traduction et peut interférer avec l’efficacité de la protéine traduction4,5, nous avons examiné la distribution des miRs dans les fractions de polysome, mettant l’accent sur la réponse à I / r.

Nous avons choisi d’utiliser le modèle de perfusion de Langendorff isolés de souris et tissus récoltés dans des conditions basales de la perfusion continue, après 30 min global ischémiques et après 30 min d’ischémie suivie d’une reperfusion de 30 min. Nous avons ensuite solubilisée le tissu cardiaque et séparés des polysomes sur un gradient de sucrose, suivie de l’analyse protéomique et détection sélective des ARNm et des miARN par PCR et microarray, respectivement. Cette combinaison de méthodes représente une approche puissante pour comprendre le protéome dynamique, qui permet la détection simultanée des ARNm, miRNA et fournisseurs de services réseau, ainsi que la redistribution des protéines régulatrices, miRNA et ARNm entre fractions nontranslating, polysomes de faible rendement et les polysomes de haute efficacité (voir Figure 1). Aperçus de la régulation dynamique de ce processus seront prolongées par une analyse plus approfondie de la phosphorylation des facteurs réglementaires clés tels qu’eIF2α ou mTOR. Maintenant, ces différentes étapes sont décrites en détail.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la synthèse dynamique des protéines et le protéome impliqué dans le processus. Cette technique permet d’identifier les ARNm qui sont sélectionnés pour la traduction, les microARN qui peuvent participer au processus et interférer avec la traduction, et les protéines qui contribuent à la traduction des protéines ou qui sont elles-mêmes traduites. Cette méthode peut donner un aperçu des réponses cardiaques au stress, mais peut également être appliquée à l’étude des réponses aiguës au stress dans d’autres organes.

Miroslava Stastna, une scientifique du laboratoire de Jennifer Van Eyk, fera la démonstration de la procédure. Le jour de l’expérience, remplissez le compartiment gauche d’un mélangeur à gradient avec cinq millilitres de solution à gradient de saccharose à 15 %, et remplissez le compartiment droit avec cinq millilitres de solution à gradient de saccharose à 50 %. Ouvrez le robinet et allumez la pompe pour remuer les deux petits compartiments avec un agitateur magnétique, et utilisez un tube relié au deuxième robinet pour permettre aux solutions de saccharose mélangées de s’écouler dans un seul tube d’ultracentrifugat