הלב מגיב לפציעה של איסכמיה (I), פגיעה reperfusion (R) בצורה דינמית. עם זאת, יש קצת תובנה חריפה לשינויים סינתזת חלבונים במהלך התגובה. כדי לטפל בבעיה זו, לקחנו היתרון של השיטה ומבוססת של polysome פרופיל1 כדי לזהות שינויים בשפע חלבון המשקפים הפצה של הריבוזומים ו translational גורמים רגולטוריים מ ציטוזול כדי polysomes, ו לודיג לאחרונה מסונתז חלבונים (NSPs). בסביבה של אני / R, הגדלת סינתזת החלבון החדש מתרחש במסגרת זמן זה אינו עולה בקנה אחד עם שעתוק של mRNAs חדש2; יתר על כן, הכתבים בין רמות הביטוי mRNA ושפע חלבון כבר דווח על3. מסיבות אלה, בחרנו לנתח השינויים פרוטאום דינמי כפי שהיא משתקפת תרגום החלבון. כדי לעשות זאת, אנחנו לכמת mRNA שברים polysome, ולנתח את הרכב החלבון בשברים polysome. לבסוף, מאחר מיקרו Rna (מירס) לווסת את הזמינות של mRNAs לתרגום יכולים להפריע היעילות של חלבון תרגום4,5, בדקנו את ההפצה של מירס בחלקים polysome, התמקדות תגובה / רבי
בחרנו להשתמש בעכבר מבודד Langendorff זלוף המודל לבין רקמת שנקטפו בתנאים הבזליים של רציף זלוף, אחרי איסכמיה זרימה לא גלובלי 30 דקות, ואחרי 30 דקות של איסכמיה ואחריו 30 דקות של פגיעה reperfusion. אנחנו solubilized את רקמת הלב ואז מופרדים polysomes מעבר הדרגתי סוכרוז, ואחריו פרוטיאומיה מבנית ניתוח וזיהוי סלקטיבי של mRNAs ושל miRNAs ע י PCR microarray, בהתאמה. שילוב זה של שיטות מייצג גישה רב-עוצמה להבנת פרוטאום דינמי, המאפשר זיהוי סימולטני של mRNA, miRNA, NSPs, כמו גם הפצה מחדש של חלבוני, miRNA ו- mRNA בין שברים nontranslating, יעילות נמוכה polysomes, יעילות גבוהה polysomes (ראה איור 1). תובנות ברגולציה דינמי של תהליך זה יורחב על ידי ניתוח נוסף של זירחון של גורמים רגולטוריים מרכזיים כגון eIF2α או mTOR. צעדים בודדים אלה מתוארים עכשיו בפירוט.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי סינתזת חלבון דינמית והפרוטאום המעורב בתהליך. טכניקה זו מאפשרת לזהות את ה-mRNA שנבחרו לתרגום, את המיקרו-רנ"א שיכולים להשתתף בתהליך ולהפריע לתרגום, ואת החלבונים התורמים לתרגום החלבונים או שהם עצמם מתורגמים. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תגובות לבביות ללחץ, אך ניתן ליישם אותה גם לחקר תגובות חריפות ללחץ באיברים אחרים.
מי שתדגים את ההליך תהיה מירוסלבה סטסטנה, מדענית הפרויקט מהמעבדה של ג'ניפר ואן אייק. ביום הניסוי, מלאו את התא השמאלי של מערבל שיפוע בחמישה מיליליטר של תמיסת שיפוע סוכרוז של 15%, ומלאו את התא הימני בחמישה מיליליטר של תמיסת שיפוע סוכרוז של 50%. פתח את הברז והפעל את המשאבה כדי לערבב את שני התאים הקטנים בעזרת מערבל מגנטי, והשתמש בצינור המקושר לברז השני כדי לאפשר לתמיסות הסוכרוז המעורבות לזרום לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה יחיד עם קירות דקים על קרח.
לאחר מכן, הומוגניזציה של רקמת הלב הטרייה או הקפואה עם POLYTRON במאגר ליזה מסונן למשך 15 שניות על קרח. בסוף הדגירה, צנטריפוגה את הליזאט כדי להסיר את החומר הבלתי מסיס, ולקצור את הסופרנטנט. הקצו 50 מיקרוליטר של הסופרנטנט לקביעת חלבון, בידוד רנ"א וניתוח שלמות רנ"א, ושכבה של 100 עד 500 מיקרוליטר של הסופרנטנט הנותר מעל תמיסת השיפוע.
השתמש במאגר ליזה טרי כדי לאזן את הנפחים בין שני צינורות השיפוע, ואו