Il cuore risponde al pregiudizio di ischemia (I) e di riperfusione (R) in modo dinamico. Tuttavia, non esiste una visione poco in cambiamenti acuti nella sintesi delle proteine durante la risposta. Per risolvere questo problema, abbiamo approfittato del metodo consolidato di polisoma profilatura1 per identificare le modifiche in abbondanza di proteine che riflettono la ridistribuzione dei ribosomi e fattori di regolazione traduzionale dal citosol di polisomi, e la aumento di proteine recentemente sintetizzati (NSP). Nell'impostazione di I / R, l'aumento nella sintesi di nuove proteine avviene in un lasso di tempo che non è coerente con la trascrizione di mRNA nuovo2; Inoltre, discordanza tra i livelli di espressione di mRNA e proteina abbondanza è stato segnalato3. Per queste ragioni, abbiamo scelto di analizzare i cambiamenti nel proteoma dinamico come riflesso dalla traduzione della proteina. Per fare questo, abbiamo quantificare mRNA nelle frazioni polisoma e analizzare la composizione della proteina nelle frazioni polisoma. Infine, perché i microRNA (miRs) regolano la disponibilità dei mRNAs per traduzione e possono interferire con l'efficienza di proteina traduzione4,5, abbiamo esaminato la distribuzione di Mir nelle frazioni polisoma, concentrandosi sulla risposta a I / r.
Abbiamo scelto di utilizzare il modello di aspersione di isolato mouse Langendorff e tessuto raccolto in condizioni basali della perfusione continua, dopo ischemia globale di no--flusso 30 min e dopo 30 min di ischemia seguita da 30 min di riperfusione. Abbiamo poi solubilizzato il tessuto cardiaco e separato polisomi sopra un gradiente di saccarosio, seguita da analisi proteomica e rivelazione selettiva del mRNA e Mirna mediante PCR e microarray, rispettivamente. Questa combinazione di metodi rappresenta un approccio potente per comprendere il proteoma dinamico, consentendo la rilevazione simultanea di mRNA, miRNA e NSP, così come la ridistribuzione delle proteine regolatrici, miRNA e mRNA tra le frazioni di nontranslating, bassa efficienza polisomi e ad alta efficienza polisomi (Vedi Figura 1). Intuizioni la regolazione dinamica di questo processo saranno esteso da un'ulteriore analisi della fosforilazione di fattori regolatori chiave quali eIF2α o mTOR. Questi singoli passi ora sono descritti dettagliatamente.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla sintesi proteica dinamica e sul proteoma coinvolto nel processo. Questa tecnica consente di identificare gli mRNA che vengono selezionati per la traduzione, i microRNA che possono partecipare al processo e interferire con la traduzione e le proteine che contribuiscono alla traduzione delle proteine o che vengono esse stesse tradotte. Questo metodo può fornire informazioni sulle risposte cardiache allo stress, ma può anche essere applicato allo studio delle risposte acute allo stress in altri organi.
A dimostrare la procedura sarà Miroslava Stastna, una scienziata del progetto del laboratorio di Jennifer Van Eyk. Il giorno dell'esperimento, riempire lo scomparto sinistro di un miscelatore a gradiente con cinque millilitri di soluzione a gradiente di saccarosio al 15% e riempire lo scomparto destro con cinque millilitri di soluzione a gradiente di saccarosio al 50%. Aprire il rubinetto e accendere la pompa per mescolare i due piccoli scomparti con un agitatore magnetico, quindi utilizzare un tubo collegato al secondo rubinetto per consentire alle soluzioni di saccarosio miscelate di fluire in un'unica provetta per ultracent