中心部は、(I) 虚血と再灌流 (R) ダイナミックなファッションでの傷害に応答します。ただし、応答の中にタンパク質合成に急性の変化に少し洞察力があります。これに対処するため行ったリボゾームとポリソーム、細胞質から並進規制要因の再分配を反映したタンパク質豊富に変更を識別するために1をプロファイリング ポリソームの確立方法の利点と新しく合成されたタンパク質 (Nsp) の増加します。私の設定で/R、新しい Mrna2; の転写と一貫性がないタイム フレームでの蛋白合成の増加が発生しますまた、mRNA 発現および蛋白質量の不一致は、報告された3をされています。これらの理由から、タンパク質翻訳を反映して動的プロテオームの変化を分析することを選びました。これを行うには、我々 はポリソーム分数の mRNA を定量化し、ポリソーム分数のタンパク質組成を分析します。最後に、マイクロ Rna (miRs) Mrna の翻訳の可用性を調節するタンパク質翻訳4、5の効率を妨げることができますので、我々 の分布を調べた miRs ポリソーム画に焦点を当て、私への応答/r.

マウス単離蛍光灌流モデルと持続灌流、30 分虚血流入なしと虚血後再灌流の 30 分, 30 分後の基底条件下で収穫された組織を使用決定しました。心臓組織を可溶化し、ショ糖密度勾配をポリソームを区切ってそれぞれプロテオーム解析と Mrna と PCR、マイクロ アレイ、miRNAs の選択的検出が続きます。このメソッドの組み合わせを表す NSPs、マイクロ Rna、mRNA の同時検出だけでなく、nontranslating の分数の間調節タンパク質、マイクロ Rna、mRNA の再配布を有効にするプロテオームを理解するための強力なアプローチ低効率ポリソームと高効率ポリソーム (図 1参照)。この過程の動的調節への洞察力は、神経: Eif2 など mTOR 因子のリン酸化の詳細な分析によって拡張されます。これらの個々 のステップは、今詳細に説明します。

この方法は、動的タンパク質合成とプロセスに関与するプロテオームに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術により、翻訳対象として選択されているmRNA、プロセスに関与して翻訳を妨害する可能性のあるマイクロRNA、およびタンパク質の翻訳に寄与するタンパク質またはそれ自体が翻訳されているタンパク質を同定できます。この方法は、ストレスに対する心臓の反応に関する洞察を提供するだけでなく、他の臓器のストレスに対する急性反応の研究にも適用できます。

この手順を実演するのは、Jennifer Van Eykの研究室のプロジェクトサイエンティストであるMiroslava Stastnaです。実験当日は、グラジエントミキサーの左側のコンパートメントに5ミリリットルの15%スクロース勾配溶液を充填し、右側のコンパートメントに5ミリリットルの50%スクロース勾配溶液を充填します。タップを開けてポンプのスイッチを入れ、マグネチックスターラーで2つの小さなコンパートメントを攪拌し、2番目のタップにリンクされたチューブを使用して、混合ショ糖溶液を氷上の薄い壁を持つ単一の超遠心チューブに流します。

次に、新鮮または凍結した心臓組織を、ろ過した溶解バッファー中のPOLYTRONで氷上で15秒間ホモジナイズします。インキュベーションの最後に、ライセートを遠心分離して不溶性物質を除去し、上清を回収します。タンパク質測定、RNA単離、およびRNA完全性分析のために50マイクロリットルの上清を確保し、残りの上清を100〜500マイクロリットルをグラジエント溶液の上に重ねます。

新鮮な溶解バッファーを使用して、2つのグラジエントチューブ間の容量のバランスを取り、スイングバケットローターを備えた超遠心分離機でサンプルを超遠心分離します。遠心分離の前後にショ糖の勾配を乱さないように十分注意してください。グラジエントを収集するには、フラクションコレクターをプログラムして、収集の最初の3分間を破棄し、254ナノメートルでの吸光度を連続的に監視しながら、4分から19分までの17のフラクションで1分あたり1ミリリットルの速度で重、軽、非翻訳のフラクションを収集します。

各フラクションが集められたらすぐに氷の上に置きます。次に、サンプルがすぐに処理されない場合は、摂氏マイナス80度でサンプルを保管します。ポリソーム画分からタンパク質を抽出するには、収集したショ糖画分を3つの最終画分に結合し、画分を重、軽、非翻訳としてマークします。

各サンプルの0.5ミリリットルを、60マイクロリットルの100%トリクロロ酢酸(TCA)と混合します。フラクションを暗所で摂氏マイナス20度で一晩インキュベートします。翌朝、サンプルを氷上で解凍してから、遠心分離によりタンパク質をペレット化します。

上清を捨て、遠心分離ごとにマイナス20°C