마음은 (I) 허 혈과 reperfusion 동적 방식에서 (R)의 부상에 응답합니다. 그러나, 응답 하는 동안 단백질 합성의 급성 변화에 약간의 통찰력이 있다. 이 해결 하기 위해 우리가 했다 polysome1 단백질 풍부 리보솜 및 polysomes, cytosol에서 변환 규제 요인의 재분배를 반영 하는 변화를 식별 하기 위해 프로 파일링의 기초가 튼튼한 방법의 장점 및 새로 합성된 단백질 (NSPs)에 증가. 나의 설정에서 / R, 새로운 mRNAs2;의 전사와 일치 하지 않는 시간에 발생 하는 새로운 단백질 합성의 증가 또한, mRNA 식 수준 및 단백질 풍부 사이 부조화 보고3되었습니다. 이러한 이유로, 우리는 동적 프로테옴에서 변경 내용을 분석 하는 단백질 번역에 의해 반영 하기로 결정 했다. 이렇게 하려면, 우리는 polysome 분수에서 mRNA를 계량 하 고 polysome 분수의 단백질 구성을 분석. 마지막으로, microRNAs (미르) 번역에 대 한 mRNAs의 조절 및 단백질 번역4,5의 효율을 방해할 수 있습니다, 때문에 우리 검사 polysome 분수에 미르의 배포에 초점을 맞추고는 내가 응답 / R.

우리는 지속적인 관류, 그리고 국 소 빈 혈 reperfusion의 30 분 뒤의 30 분 30 분 글로벌 아니 흐름 허 혈 후의 기저 상태에서 수확 조직과 격리 마우스 Langendorff 관류 모델을 사용 하기로 결정 했습니다. 우리 심장 조직의 solubilized 그리고 자당 기온 변화도 통해 polysomes를 분리 proteomic 분석 및 선택적 검출 mRNAs와 PCR 및 microarray, miRNAs의 각각 다음. 방법의이 조합은 mRNA, 미르, NSPs의 동시 검출 뿐만 아니라 nontranslating 분수 사이 규제 단백질, 미르, 그리고 mRNA의 재배포 가능 동적 프로테옴을 이해 하는 강력한 접근 방식을 나타냅니다. 낮은 효율 polysomes, 그리고 높은 효율 polysomes ( 그림 1참조). 이 프로세스의 동적 규칙에 eIF2α 또는 mTOR 등 규제 요인의 인 산화의 더 분석 하 여 연장 됩니다. 이러한 개별 단계 이제 자세히 설명 합니다.

이 방법은 동적 단백질 합성 및 공정에 관련된 단백질체에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 번역을 위해 선택되는 mRNA, 과정에 참여하여 번역을 방해할 수 있는 microRNA, 단백질 번역에 기여하거나 자체적으로 번역되는 단백질을 식별할 수 있습니다. 이 방법은 스트레스에 대한 심장 반응에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 장기의 스트레스에 대한 급성 반응 연구에도 적용할 수 있습니다.

이 절차를 시연하는 사람은 Jennifer Van Eyk 실험실의 프로젝트 과학자인 Miroslava Stastna입니다. 실험 당일, 그래디언트 믹서의 왼쪽 구획에 5ml의 15% 자당 그래디언트 용액을 채우고 오른쪽 구획에 50%슈크로스 그래디언트 용액 5ml를 채웁니다. 탭을 열고 펌프를 켜서 자석 교반기로 두 개의 작은 구획을 저어주고 두 번째 탭에 연결된 튜브를 사용하여 혼합된 자당 용액이 얼음 위에 얇은 벽이 있는 단일 초원심분리기 튜브로 흐르도록 합니다.

다음으로, 얼음 위에서 15초 동안 여과된 용해 완충액의 POLYTRON으로 신선하거나 냉동된 심장 조직을 균질화합니다. 배양이 끝나면 용해물을 원심 분리하여 불용성 물질을 제거하고 상등액을 수확합니다. 단백질 측정, RNA 분리 및 RNA 무결성 분석을 위해 50마이크로리터의 상층액을 따로 보관하고 그래디언트 용액 위에 100-500마이크로리터의 나머지 상등액을 층을 이룹니다.

새로운 용해 버퍼를 사용하여 두 gradient tube 사이의 부피 균형을 맞추고, 스윙 버킷 로터를 사용하여 초원심분리기에서 샘플을 초원심분리합니다. 원심분리 전이나 후에 자당 구배를 방해하지 않도록 매우 주의하십시오. 그래디언트를 수집하기 위해 분획 분취기가 처음 3분 동안의 분취를 버리고 254나노미터에서 흡광도를 지속적으로 모니터링하면서 4분에서 19분까지 17분획으로 분당 1밀리리터의 속도로 무겁고 가벼우며 변환되지 않는 분획을 수집하도록 프로그래밍합니다.

각 조각을 모으는 즉시 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 샘플을 즉시 처리하지 않는 경우 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 폴리솜 분획에서 단백질을 추출하려면 수집된 자당 분획을 3개의 최종 분획으로 결합하고 분획을 무겁고 가벼우며 비평행 분석으로 표시합니다.

각 시료 0.5ml를 100% 트리클로로아세트산 또는 TCA 60마이크로리터와 혼합합니다. 어둠 속에서 섭씨 영하 20도의 온도에서