Het hart komt tegemoet aan de schade van ischemie (I) en reperfusie (R) op een dynamische wijze. Er is echter weinig inzicht in acute wijzigingen in de eiwitsynthese tijdens de reactie. Om aan te pakken dit, wij profiteerde van de gevestigde methode van Polysoom1 ter identificatie van wijzigingen in eiwit overvloed die overeenkomen met herverdeling van ribosomen en translationeel regelgevende factoren van cytosol te polysomes, profilering en de stijging van de nieuw samengestelde eiwitten (OvN's). In de omgeving van I / R, de toename van nieuwe eiwitsynthese plaatsvindt in een tijdsbestek dat strookt met de transcriptie van nieuwe mRNAs2; Bovendien is verschil tussen mRNA uitdrukking niveaus en eiwit overvloed gerapporteerde3geweest. Om deze redenen, die wij hebben gekozen voor het analyseren van de wijzigingen in de dynamische Proteoom, zoals blijkt uit eiwit vertaling. Om dit te doen, we mRNA te kwantificeren in de Polysoom breuken, en analyseren van de samenstelling van eiwit in de Polysoom breuken. Ten slotte, omdat microRNAs (miRs) beschikbaarheid van mRNAs vertaaldienst reguleren en met de efficiëntie van eiwit vertaling4,5 interfereren kan, onderzochten we de verdeling van miRs in de Polysoom-fracties, zich te concentreren op de reactie op ik / R.
We kozen de geïsoleerde Langendorff perfusie muismodel en geoogste weefsel onder basale voorwaarden voor continue perfusie, na 30 min global neen-flow ischemie en na 30 min van ischemie gevolgd door 30 min van reperfusie te gebruiken. We solubilized het hartweefsel en gescheiden polysomes over een helling van sacharose, gevolgd door Proteoom analyse en selectieve opsporing van mRNAs en miRNAs door PCR en microarray, respectievelijk. Deze combinatie van methoden vertegenwoordigt een krachtige aanpak voor het begrip van de dynamische Proteoom, waardoor gelijktijdige opsporing van mRNA, miRNA, en OvN's, evenals de herverdeling van regelgevende eiwitten, miRNA en mRNA tussen de fracties van het nontranslating, lage-efficiëntie polysomes en hoog rendement polysomes (Zie Figuur 1). Inzicht in de dynamische regulering van dit proces zal worden uitgebreid door de verdere analyse van fosforylering van belangrijke regelgevende factoren zoals eIF2α of mTOR. Deze individuele stappen worden nu in detail beschreven.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over dynamische eiwitsynthese en het proteoom dat bij het proces betrokken is. Deze techniek maakt identificatie mogelijk van de mRNA's die geselecteerd worden voor translatie, de microRNA's die kunnen deelnemen aan het proces en interfereren met translatie, en de eiwitten die bijdragen aan eiwittranslatie of zelf worden vertaald. Deze methode kan inzicht geven in hartreacties op stress, maar kan ook worden toegepast op de studie van acute reacties op stress in andere organen.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Miroslava Stastna, een projectwetenschapper uit het laboratorium van Jennifer Van Eyk. Op de dag van het experiment, vult u het linker compartiment van een gradiëntmixer met vijf milliliter 15% sucrose gradiëntoplossing, en vult u het rechter compartiment met vijf milliliter 50% sucrose gradiëntoplossing. Open de kraan en zet de pomp aan om de twee kleine compartimenten met een magnetische roerder te roeren, en gebruik een buis verbonden met de tweede kraan om de gemengde sucroseoplossingen te laten stromen in een enkele ultracentrifugebuis met dunne wanden op ijs.
Homogeniseer vervolgens het verse of