Serce reaguje na uraz spowodowany niedokrwieniem (I) i reperfuzją (R) w sposób dynamiczny. Jednak niewiele jest wglądu w ostre zmiany w syntezie białek podczas odpowiedzi. Aby rozwiązać ten problem, wykorzystaliśmy sprawdzoną metodę profilowania polisomów1, aby zidentyfikować zmiany w obfitości białek, które odzwierciedlają redystrybucję rybosomów i translacyjnych czynników regulacyjnych od cytozolu do polisomów oraz wzrost nowo zsyntetyzowanych białek (NSP). W ustawieniu I/R wzrost syntezy nowych białek następuje w ramach czasowych, które są niespójne z transkrypcją nowych mRNAs2; ponadto odnotowano niezgodność między poziomami ekspresji mRNA a obfitością białka3. Z tych powodów zdecydowaliśmy się przeanalizować zmiany w dynamicznym proteomie odzwierciedlone przez translację białek. Aby to zrobić, oznaczamy ilościowo mRNA we frakcjach polisomów i analizujemy skład białek we frakcjach polisomów. Wreszcie, ponieważ mikroRNA (miR) regulują dostępność mRNA do translacji i mogą zakłócać wydajność translacji białek4,5, zbadaliśmy rozkład miR we frakcjach polisomów, koncentrując się na odpowiedzi na I/R.
Zdecydowaliśmy się użyć izolowanego mysiego modelu perfuzji Langendorffa i pobraliśmy tkankę w podstawowych warunkach ciągłej perfuzji, po 30 minutach globalnego niedokrwienia bez przepływu, a następnie po 30 minutach niedokrwienia, a następnie 30 minutach reperfuzji. Następnie rozpuściliśmy tkankę serca i oddzieliliśmy polisomy w gradiencie sacharozy, a następnie przeprowadziliśmy analizę proteomiczną i selektywne wykrywanie mRNA i miRNA odpowiednio za pomocą PCR i mikromacierzy. Ta kombinacja metod stanowi potężne podejście do zrozumienia dynamicznego proteomu, umożliwiając jednoczesne wykrywanie mRNA, miRNA i NSP, a także redystrybucję białek regulatorowych, miRNA i mRNA między frakcjami nietranslacyjnymi, polisomami o niskiej wydajności i polisomami o wysokiej wydajności (patrz Rysunek 1). Wgląd w dynamiczną regulację tego procesu zostanie poszerzony o dalszą analizę fosforylacji kluczowych czynników regulacyjnych, takich jak eIF2α czy mTOR. Te poszczególne kroki są teraz szczegółowo opisane.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące dynamicznej syntezy białek i proteomu zaangażowanego w ten proces. Technika ta umożliwia identyfikację mRNA, które są wybierane do translacji, mikroRNA, które mogą uczestniczyć w procesie i zakłócać translację, oraz białek, które przyczyniają się do translacji białek lub same są poddawane translacji. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat reakcji serca na stres, ale może być również zastosowana do badania ostrych reakcji na stres w innych narządach.
Procedurę zademonstruje Miroslava Stastna, naukowiec z laboratorium Jennifer Van Eyk. W dniu eksperymentu napełnij lewą komorę miksera gradientowego pięcioma mililitrami 15% roztworu gradientu sacharozy, a prawą komorę napełnij pięcioma mililitrami 50% roztworu gradientu sacharozy. Otwórz kran i włącz pompę, aby wymieszać dwie małe komory za pomocą mieszadła magnetycznego i użyj rurki połączonej z drugim kranem, aby umożliwić przepływ zmieszanych roztworów sacharozy do jednej probówki ultrawirówki o cienkich ściankach na lodzie.
Następnie homogenizuj świeżą lub zamrożoną tkankę serca za pomocą POLYTRONU w przefiltrowanym buforze do lizy przez 15 sekund na lodzie. Pod k