Сердце реагирует к ушибу ишемии (I) и реперфузии (R) в динамических моды. Однако есть меньшюю проницательность в острой изменения в синтезе белков во время ответа. Для решения этой проблемы, мы воспользовались устоявшихся метода профилирования1 для выявления изменений в изобилии белков, которые отражают перераспределение рибосомы и трансляционная регуляторные факторы от цитозоль для polysomes, Полисома и увеличение вновь синтезируемых белков (ПСУ). В обстановке я / R, увеличение синтеза новых белков происходит в сроки, что является несовместимым с транскрипцией новой мРНК2; Кроме того отсутствие согласованности между уровнями выражение mRNA и изобилие белка был сообщил3. По этим причинам мы решили проанализировать изменения в динамических протеома как отражение переводом белка. Чтобы сделать это, мы количественно мРНК в Полисома фракций и анализировать состав белка в Полисома фракции. Наконец, потому что микроРНК (Мирс) регулирования доступности мРНК для перевода и может мешать эффективности белка перевод4,5, мы исследовали распределение Мирс в Полисома фракций, сосредоточив внимание на ответ на я / R.

Мы решили использовать модель изолированных мыши Langendorff перфузии и заготовленной ткани в базальных условиях непрерывной перфузии, после 30 мин глобального потока нет ишемии и после 30 минут ишемии, следуют 30 мин реперфузии. Затем мы солюбилизирован ткани сердца и разделенные polysomes над градиентом сахарозы, следуют протеомного анализа и селективного выявления мРНК и адаптивной ПЦР и microarray дна, соответственно. Это сочетание методов представляет собой мощный подход к пониманию динамический протеом, позволяя одновременного обнаружения мРНК, Мирна, и Энни, а также перераспределения регуляторных белков, Мирна и мРНК nontranslating фракции, низкая эффективность polysomes и polysomes высокой эффективности (см. Рисунок 1). Понимание динамического регулирования этого процесса будет расширен путем дальнейшего анализа фосфорилирования ключевых регулирующих факторов, таких как eIF2α или mTOR. Теперь эти отдельные шаги описаны в деталях.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о динамическом синтезе белка и протеоме, участвующем в этом процессе. Этот метод позволяет идентифицировать мРНК, которые отбираются для трансляции, микроРНК, которые могут участвовать в процессе и мешать трансляции, а также белки, которые участвуют в трансляции белка или сами транслируются. Этот метод может дать представление о сердечных реакциях на стресс, но также может быть применен для изучения острых реакций на стресс в других органах.

Демонстрировать процедуру будет Мирослава Штястна, научный сотрудник проекта из лаборатории Дженнифер Ван Эйк. В день эксперимента заполните левый отсек градиентного миксера пятью миллилитрами 15% раствора градиента сахарозы, а правый отсек — пятью миллилитрами 50% раствора градиента сахарозы. Откройте кран и включите насос, чтобы перемешать два небольших отсека с помощью магнитной мешалки, и используйте трубку, соединенную со вторым краном, чтобы смешанные растворы сахарозы стекали в одну ультрацентрифужную пробирку с тонкими стенками на льду.

Затем гомогенизируйте свежую или замороженную сердечную ткань с помощью POLYTRON в фильтрованном буфере для лизиса в течение 15 секунд на льду. В конце