鉴定坏死性凋亡的遗传组分促进了利用动物模型来研究坏死性凋亡在生理和疾病中的作用¹^,²^,³^,⁴^,⁵。在小鼠中敲除RIPK3或MLKL对发育和成体稳态影响甚微，提示坏死性凋亡对生命并非必需³^,⁶。此外，某些物种本身缺乏RIPK3或MLKL基因，进一步支持坏死性凋亡在动物中非必需的观点⁷^,⁸。另一方面，通过在实验室诱导多种病理状态来挑战这些基因敲除动物模型，已揭示坏死性凋亡在炎症、天然免疫和病毒感染中具有重要作用⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²。

坏死性凋亡可通过多种方式激活，这些方式涉及不同的天然免疫传感器信号通路，最终均导致RIPK3的活化¹^,¹³^,¹⁴。活化的RIPK3继而磷酸化并激活MLKL³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸。其中研究最为深入且可能最为复杂的RIPK3激活途径涉及死亡受体的配体结合，该信号通路根据下游信号复合物的组成不同，可分别诱导凋亡或坏死性凋亡¹。当信号通路倾向于通过RIPK1传导时，便会招募RIPK3，从而引发坏死性凋亡¹⁹^,²⁰。当胱天蛋白酶8（caspase 8）被药理学抑制或基因敲除时，该结果更容易发生；caspase 8是一种假定的坏死性凋亡内源性抑制因子，通常可抑制坏死性凋亡的发生。RIPK1通过结合并激活RIPK3发挥作用。另一种激活坏死性凋亡的途径是通过Toll样受体TLR3/TLR4信号通路，该通路通过含有TIR结构域的干扰素-β诱导适配蛋白（TRIF）招募并激活RIPK3²¹。还有一种导致细胞发生坏死性凋亡的方式是通过激活DNA感受器DAI，后者可直接结合并激活RIPK3²²。

MLKL 是一种胞质蛋白，由 N 端螺旋束（NB）结构域和 C 端假激酶结构域（psKD）组成，二者通过一个调节性连接区（brace region）相连³。在正常细胞中，MLKL 存在于胞质中，被认为与 RIPK3 形成无活性的复合物¹⁴。坏死性凋亡的激活会触发 RIPK3 对 MLKL 假激酶结构域激活环的磷酸化，也可能磷酸化 NB 结构域和连接区的其他位点³^,¹⁵^,²³。磷酸化诱导 MLKL 发生构象改变，导致其从 RIPK3 上解离¹⁴。目前尚不完全清楚的构象变化使连接区从 psKD 上释放出来²⁴。该连接区包含两条螺旋，通过其 C 端螺旋介导 MLKL 寡聚化，形成假定的三聚体²⁵。连接区的 N 端螺旋抑制 NB 结构域的活性，而 NB 结构域对细胞膜通透化至关重要²⁴^,²⁶。单独存在的 NB 结构域足以诱导质膜通透化和坏死性凋亡¹⁶^,²⁴^,²⁷。NB 的促坏死性凋亡活性已在缺乏 MLKL 的小鼠胚胎成纤维细胞（mlkl^-/- MEFs）中重建。NB 是一个脂质结合结构域，优先结合磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸（PIP₂）。我们提出 MLKL 激活的逐步机制：连接区的寡聚化通过 NB 与 PIP₂ 极性头部基团的弱相互作用，促进 MLKL 向质膜募集²⁴。在膜上，NB 结构域暴露出另一个高亲和力的 PIP₂ 结合位点，该位点在非活性 MLKL 中被连接区所遮蔽。总体而言，NB 与 PIP₂ 的多重相互作用破坏了质膜的稳定性，最终导致膜破裂，但这些事件的分子机制尚未阐明。

在此，我们展示用于表征MLKL作为坏死性凋亡执行者功能的具体方法²⁴特别是，我们聚焦于MLKL最小的功能结构域——N端结构域与连接臂（NBB）。该结构域受连接臂介导的抑制调控，可通过强制性二聚化被激活，从而引发细胞膜破裂和坏死性凋亡。我们介绍了可诱导表达系统，并结合药物诱导的FKBP介导的强制性二聚化方法，用于经历坏死性凋亡的细胞的活细胞成像和电子显微镜观察。此外，我们还阐述了我们的体外 NBB与磷脂酰肌醇（PIPs）相互作用的核磁共振分析

这些方法有助于解答关于假激酶混合谱系激酶样蛋白（MLKL）在坏死性凋亡中作用的关键问题，例如其在脂质结合过程中的膜转位和通透化。这些技术的主要优势在于能够直接证明MLKL是坏死性凋亡中细胞膜破裂的执行者。活细胞成像技术彻底改变了细胞死亡研究领域，尤其推动了MLKL介导的坏死性凋亡研究。

核磁共振是一种强大的技术，可用于监测脂质与蛋白质的结合，本文以MLKL为例进行了演示。首先，在24孔板中每孔加入1毫升添加了补剂的DMEM培养基，并接种5×10⁴个表达MLKL执行结构域（与寡聚化盒及Venus蛋白融合）的MLKL基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），每孔接种一次，置于细胞培养箱中过夜培养。次日早晨，用多西环素处理细胞12小时以诱导转基因表达，随后加入补充了FK506结合蛋白二聚化试剂和细胞膜非通透性绿色荧光染料的标准DMEM培养基，以诱导细胞发生坏死性凋亡。

为了监测细胞死亡，将培养板放入位于哺乳动物组织培养箱内的合适成像设备中，并打开成像系统软件。选择“计划 upcoming 扫描”选项卡，在“物理布局”选项卡中选择托盘、容器、扫描类型和扫描模式。在“属性”选项卡中选择快速荧光，然后点击“时间线”窗口，设置总时间点数量和采集频率，以添加扫描时间。

然后，点击“应用”以开始图像采集。为了定量分析坏死性凋亡，选择“任务”面板，将鼠标悬停在多张图像的背景区域，以在背景信号水平之上设置具有固定分割阈值的物体计数新分析。接着，选择“预览”以检查当前图像中的荧光物体，并根据需要优化阈值水平。

可通过观察孔板上的多个孔并使用软件中的预览功能，仔细选择阈值。请注意，孔板中所有孔的阈值设置应保持一致。为整合绿色荧光计数，在“启动新分析”选项卡下选择时间范围和待分析的孔，并输入分析任务名称。

然后，单击“确定”，并双击作业名称，将数据导出至适当的绘图软件中进行进一步分析。对于通过核磁共振波谱法（NMR）检测MLKL与脂质的结合，应使用密封的注射器将目标磷脂以每毫升一毫克的浓度分装至洁净的玻璃小瓶中，用于单独的NMR滴定实验，并将小瓶置于氩气或氮气气流下吹扫五到三十分钟。从氯仿或甲醇等挥发性溶剂中分装脂质时，必须迅速操作，且脂质储备液需保存在干冰上，以尽量减少因溶剂挥发而导致样品间脂质浓度不一致的情况。

蒸发结束后，使用大号镊子将小瓶置于布氏烧瓶底部。用橡胶塞密封烧瓶，并连接连接至真空管线的塑料管，在温和真空条件下抽气过夜，以除去残留的有机溶剂。次日早晨，向每支含有脂质膜的玻璃小瓶中加入含有去垢剂的核磁共振缓冲液，使其达到适当的实验浓度，随后将小瓶置于水浴中超声处理最多30分钟，每10分钟停止一次超声，检查脂质膜的溶解情况。

超声处理结束后，让样品管静置冷却15分钟，然后在含去垢剂的NMR缓冲液中对脂质-去垢剂胶束进行系列稀释，将1:1混合物超声处理以获得所需浓度梯度。分别在不含去垢剂和含

坏死性凋亡中MLKL介导的质膜破裂的表征