Identifizierung von genetischen Komponenten des Necroptosis hat die Verwendung von Tiermodellen, die Implikation des Necroptosis in Physiologie und Krankheit¹^,²^,³^,⁴^,⁵testen erleichtert. Ko von RIPK3 oder MLKL bei Mäusen hatten minimal Implikation in Entwicklung und Erwachsenen Homöostase, was darauf hindeutet, dass diese Necroptosis nicht für wichtig Leben³^,⁶. Darüber hinaus enthalten bestimmte Arten entweder RIPK3 oder MLKL Gene, Unterstützung der unwesentliche Rolle der Necroptosis in Tiere⁷^,⁸. Auf der anderen Seite hat anspruchsvolle ko Tiermodellen mit verschiedenen Pathologien im Labor induziert eine wichtige Rolle bei Entzündungen, angeborene Immunität und Virusinfektion⁹^,¹⁰^, Necroptosis ergeben ¹¹ ^, ¹².

Necroptosis kann auf verschiedene Weise durch Signalisierung durch verschiedene angeborene Immunität Sensoren aktiviert werden alle die sich bei der Aktivierung von RIPK3¹^,¹³^,¹⁴. Aktive RIPK3 wiederum phosphorylates und aktiviert MLKL³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰ ^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Die meisten studierte, und vielleicht der komplexeste Weg, führt zu einer Aktivierung des RIPK3 beinhaltet Tod Rezeptor Ligatur, die gabelt basierend auf die nachgelagerten Zusammensetzung der Signalisierung komplexe entweder induzieren Apoptose oder Necroptosis¹. Necroptosis entsteht, wenn durch RIPK1 Signalisierung begünstigt wird und zu Engagement von RIPK3¹⁹^,^{20 führt}. Dieses Ergebnis ist leicht begünstigt auf pharmakologische Hemmung oder genetische Löschung von Caspase 8, eine vermeintliche endogener Inhibitor des Necroptosis, die Necroptosis in Schach hält. RIPK1 bindet an und aktiviert RIPK3. Eine weitere Möglichkeit, Necroptosis zu aktivieren ist durch Toll-Like-Rezeptoren TLR3/TLR4 Signaltechnik, die eingreift und aktiviert RIPK3 durch TIR-Domain-haltigen Adapter-induzierende Interferon-β (SIMPE)²¹. Noch ist eine andere Art zu sterben durch Necroptosis durch Aktivierung der DNA-Sensor DAI, der direkt eingreift und aktiviert RIPK3²².

MLKL ist ein cytosolischen Protein, bestehend aus einer N-terminalen Helix-Bundle (NB)-Domäne und einer C-terminalen Pseudokinase Domäne (PsKD) durch eine regulatorische Klammer Region³verbunden. In normalen Zellen ist MLKL in das Zytosol gefunden wo es angenommen wird, in einem inaktiven Komplex mit RIPK3¹⁴. Aktivierung des Necroptosis löst RIPK3 Phosphorylierung des MLKL in der Aktivierung der PsKD und möglicherweise weitere Standorte in der NB und Klammer³^,¹⁵^,²³. Phosphorylierung bewirkt eine Konformationsänderung in MLKL, der Dissoziation von RIPK3¹⁴führt. Schlecht verstandene Konformationsänderungen lassen Sie die Klammer aus dem PsKD²⁴. Die Klammer, die 2 Helices enthält, vermittelt Oligomerisierung von MLKL in einem vermeintlichen Trimer durch die C-terminale Helix²⁵. Die N-terminale Helix der Orthese hemmt die NB-Domäne, die für Membran Permeabilisierung²⁴^,²⁶unerlässlich. Isoliert reicht die NB Domäne Permeabilisierung der Plasmamembran und Necroptosis¹⁶^,²⁴^,²⁷induzieren. Die Pro-Necroptotic-Aktivität der NB wurde in Maus einen Mangel an MLKL (Mlkl^{- / -} MEFs) embryonalen Fibroblasten rekonstituiert. NB ist ein Lipid-bindende Domäne, die bevorzugt die Phospholipid-Phosphatidylinositol-4,5-Diphosphat (PIP₂) eingreift. Wir haben einen schrittweisen Mechanismus der Aktivierung des MLKL, wobei Klammer Oligomerisierung erleichtert die Einstellung des MLKL in der Plasmamembran über schwachen Wechselwirkungen der NB mit dem PIP₂ polare Kopfgruppe²⁴vorgeschlagen. An der Membran erfährt die NB geregelten Exposition eine zusätzliche High-Affinity-Bindungsstelle für PIP₂, die durch die Orthese in inaktiven MLKL maskiert wird. Insgesamt destabilisieren mehrere Interaktionen der NB mit PIP₂ der Plasmamembran zu seinen Bruch, obwohl der molekulare Mechanismus dieser Ereignisse sind nicht geklärt.

Hier zeigen wir spezifische Methoden verwendet, um die Funktion des MLKL als Vollstrecker des Necroptosis²⁴charakterisieren. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die minimalsten Domain MLKL, NB und Klammer (NBB) die Klammer Hemmung unterliegt und durch erzwungene Dimerisierung induzieren Plasmamembran Bruch und Necroptosis aktiviert werden können. Wir beschreiben unsere induzierbaren Expressionssystems kombiniert mit erzwungenen drogeninduzierte FKBP-vermittelte Dimerisierung für live Cell Imaging und Elektronenmikroskopie der Zellen Necroptosis. Darüber hinaus zeigen wir unsere in-vitro- NMR-Analyse der Interaktionen der BNB mit Phosphatidylinositols (PIPs).

Charakterisierung der MLKL-vermittelten Plasmamembran Bruch in Necroptosis