זיהוי רכיבים גנטיים של necroptosis הנחתה את השימוש במודלים לבחון את ההשלכה של necroptosis פיסיולוגיה ומחלות¹^,²^,³^,⁴^,⁵. נוקאאוט של RIPK3 או MLKL בעכברים הייתה מינימלית במשתמע הומאוסטזיס מבוגר ופיתוח רומז ש-necroptosis זו אינה חיונית עבור החיים³^,⁶. יתר על כן, מינים מסוימים אינם מכילים גנים או RIPK3 או MLKL, תומך את תפקיד שאינם חיוניים necroptosis של בעלי חיים⁷^,⁸. מצד שני, מאתגר חייתיים נוקאאוט עם פתולוגיות שונות המושרה במעבדה חשף תפקיד חשוב של necroptosis דלקת, מולדת חסינות, זיהום נגיפי⁹^,¹⁰^, ¹¹ ^, ¹².

Necroptosis יכול להיות מופעל במספר דרכים על-ידי איתות באמצעות חיישנים שונים מולדת חסינות, כל אילו התוצאה הפעלת¹³^,¹^,RIPK3¹⁴. RIPK3 פעיל phosphorylates בתורו ומפעיל MLKL³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰ ^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. למד ביותר, אולי הדרך המורכבים ביותר, שמוביל הפעלה של RIPK3 כרוך מוות קולטן מצדו, אשר bifurcates מבוסס על הרכב במורד הזרם של מתחמי איתות לזירוז או אפופטוזיס או necroptosis¹. Necroptosis מתפתח כאשר איתות באמצעות RIPK1 הוא המועדף ותוצאות האירוסין של RIPK3¹⁹^,²⁰. התוצאה היא חביבה עליהם בקלות על עיכוב תרופתי או מחיקה גנטי של קספאז 8, מעכב אנדוגני בשם של necroptosis שמחזיק necroptosis במפרץ. RIPK1 נקשר ומפעיל RIPK3. דרך נוספת להפעיל את necroptosis היא דרך רצפטורים כמו אגרה TLR3/TLR4 איתות, אשר עוסקת ומפעיל RIPK3 דרך טיר-תחום-המכיל בתדר מתאם אינטרפרון-β (TRIF)²¹. עוד דרך נוספת למות על ידי necroptosis היא על-ידי הפעלת את חיישן ה-DNA דאי, אשר עוסקת ישירות ומפעיל RIPK3²².

MLKL הוא חלבון cytosolic מורכב תחום bundle (NB) החורש N-מסוף, תחום pseudokinase C-מסוף (psKD) מקושרים על ידי אזור רגולטוריות מסולסל³. בתאים נורמליים, MLKL נמצא את ציטוזול שבו הוא חשב להיות קומפלקס לא פעיל עם RIPK3¹⁴. הפעלה של necroptosis מפעיל זרחון RIPK3 של MLKL בתמונה ההפעלה של psKD, וכן אתרים נוספים שעלולים NB ו הסד³^,¹⁵^,²³. זרחון גורם בשינוי הסתגלותי MLKL שתוצאתו דיסוציאציה מ RIPK3¹⁴. ממעטים להבין שינויים הסתגלותי לשחרר את הסוגר המסולסל מ- psKD²⁴. הסוגר, אשר מכיל את 2 helices, ומתווך oligomerization של MLKL לתוך trimer בשם דרך סליל C-מסוף²⁵. הסליל N-מסוף הסוגר מעכב את התחום NB, אשר חיוני ממברנה permeabilization²⁴^,²⁶. בבידוד, תחום NB מספיקה לגרום permeabilization קרום פלזמה ו-²⁴^,necroptosis¹⁶^,²⁷. פעילות פרו-necroptotic של NB הוקמה מחדש העכבר מתחלקים fibroblasts בנכונותם MLKL (mlkl^{- / -} MEFs). NB הוא תחום הכריכה השומנים העוסק מעדיפים את diphosphate phosphatidylinositol 4.5 פוספוליפיד (פיפ₂). אנחנו הציע מנגנון stepwise של ההפעלה של MLKL, שבו מסולסל oligomerization מקלה על גיוס של MLKL את קרום פלזמה דרך אינטראקציות החלש של NB עם קבוצה ראש קוטב₂ ²⁴פיפ. -הקרום, NB עובר מוסדר חשיפה של אתר קשירה גבוהה-זיקה נוספים פיפ₂, אשר מוסווה על ידי הסוגר המסולסל ב MLKL לא פעיל. בסך הכל, האינטראקציות מרובים של NB עם פיפ₂ יציבות קרום פלזמה המוביל שלה קרע, למרות המנגנון המולקולרי של אירועים אלה לא הובהר.

כאן אנו ממחישים שיטות ספציפיות שימוש כדי לאפיין את הפונקציה של MLKL כמו המוציא להורג של necroptosis²⁴. בפרט, אנו מתמקדים התחום הכי מזערי של MLKL, NB ו הסד (NBB), אשר מווסת על ידי עיכוב הסד והוא יכול להיות מופעל דרך dimerization שנאכפת לזירוז necroptosis ולמסמנים של קרום פלזמה. נתאר מערכת ביטוי inducible שלנו בשילוב עם שנאכפת שיכרון בתיווך FKBP dimerization עבור הדמיה לחיות תאים, ואלקטרון מיקרוסקופי של תאים שעברו necroptosis. בנוסף, אנו ממחישים את הניתוח שלנו במבחנה NMR של האינטראקציות של NBB עם phosphatidylinositols (פיפס).

שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי תפקידו של תחום קינאז מעורב פסאודו-קינאז או MLKL בנקרופטוזיס כגון טרנסלוקציה של ממברנה וחדירות בקשירת שומנים. היתרון העיקרי של טכניקות אלו הוא שהן מערבות ישירות את MLKL כמוציא לפועל של קרע בקרום הפלזמה בנקרופטוזיס. הדמיית תאים חיים חוללה מהפכה בתחום חקר מוות תאי, במיוחד עבור נקרופטוזיס בתיווך MLKL.

תהודה מגנטית גרעינית היא טכניקה רבת עוצמה לניטור קשירת שומנים לחלבונים כפי שמודגם כאן עבור MLKL. התחל בציפוי חמש פעמים 10 לפיברובלסטים עובריים של עכבר נוקאאוט MLKL או MEFs המבטאים את תחום המוציא להורג של MLKL מאוחה לקלטת אוליגומריזציה וונוס במיליליטר אחד של DMEM בתוספת צלחות של 24 בארות לדגירתם למשך הלילה בחממת תרבית תאים. למחרת בבוקר, טפל בתאים עם דוקסיציקלין במשך 12 שעות כדי לגרום לביטוי של הטרנסגן, ולאחר מכן תוספת של DMEM סטנדרטי בתוספת דימריזר חלבון קושר FK506 וצבע פלואורסצנטי ירוק אטום לממברנה כדי לגרום לנקרופטוזיס.

כדי לנטר את מוות התאים, הנח את הצלחת ביחידת הדמיה מתאימה הממוקמת באינקובטור תרבית רקמות יונקים ופתח את תוכנת מערכת ההדמיה. בחר בכרטיסייה תזמון סריקות קרובות ובחר את המגש, הכלי, סוגי הסריקה ותבנית הסריקה בכרטיסייה פריסה פיזית. בחר פלואורסצנטיות מהירה בכרטיסייה מאפיינים ולחץ על חלון ציר הזמן ועל המספר הכולל של נקודות זמן ותדירות

אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע Necroptosis