Identificazione dei componenti genetiche di necroptosis ha facilitato l'uso di modelli animali per testare l'implicazione di necroptosis in fisiologia e malattia¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Ko di RIPK3 o MLKL in topi aveva minima implicazione nell'omeostasi sviluppo e adulto, suggerendo che necroptosis non è essenziale per vita³^,⁶. Inoltre, alcune specie non contengono geni o RIPK3 o MLKL, sostenere il ruolo non essenziali di necroptosis in animali⁷^,⁸. D'altra parte, impegnativo modelli animali knockout con varie patologie indotte in laboratorio ha rivelato un importante ruolo di necroptosis nell'infiammazione, immunità innata e l'infezione virale⁹^,¹⁰^, ¹¹ ^, ¹².

Necroptosis può essere attivato in diversi modi di segnalazione attraverso sensori differenti immunità innata, tutti che provocano l'attivazione di RIPK3¹^,¹³^,¹⁴. RIPK3 attivo a sua volta fosforila e attiva MLKL³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰ ^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Il più studiato e forse il modo più complesso, che portano all'attivazione di RIPK3 coinvolge morte recettore legatura, che si biforca sulla base della composizione a valle dei complessi segnalazione sia indurre apoptosi o necroptosis¹. Necroptosis consegue quando segnalazione attraverso RIPK1 è favorita e si traduce in impegno di RIPK3¹⁹^,²⁰. Questo risultato è facilmente favorito su inibizione farmacologica o delezione genetica della caspasi 8, un inibitore endogeno putativo di necroptosis che tiene a bada il necroptosis. RIPK1 lega a ed attiva RIPK3. Un altro modo per attivare necroptosis è attraverso recettori Toll-like TLR3/TLR4 segnalazione, che coinvolge e attiva il RIPK3 TIR-dominio-contenente adattatore-induzione dell'interferone-β (TRIF)²¹. Un altro modo per morire di necroptosis è di attivazione del sensore del DNA DAI, che direttamente si impegna e si attiva RIPK3²².

MLKL è una proteina citosolica composta da un N-terminale dell'elica bundle (NB) e un dominio di pseudochinasi C-terminale (psKD) collegati da una parentesi graffa regolamentazione regione³. In cellule normali, MLKL si trova nel citosol dove si pensa di essere in un complesso inattivo con RIPK3¹⁴. Attivazione di necroptosis innesca fosforilazione di RIPK3 di MLKL nel ciclo di attivazione della psKD e potenzialmente altri siti nel NB e parentesi graffa³^,¹⁵^,²³. La fosforilazione induce un cambio conformazionale in MLKL che si traduce in dissociazione dal RIPK3¹⁴. Capito male cambiamenti conformazionali rilasciare il tutore dal psKD²⁴. L'ortesi, che contiene 2 eliche, media oligomerizzazione di MLKL in un trimero putativo attraverso il C-terminale dell'elica²⁵. L'elica del N-terminale della ginocchiera inibisce il dominio NB, che è essenziale per la permeabilizzazione della membrana²⁴^,²⁶. In isolamento, NB dominio è sufficiente per indurre la permeabilizzazione della membrana del plasma e necroptosis¹⁶^,²⁴^,²⁷. L'attività di pro-necroptotic NB è stato ricostituito in fibroblasti embrionali del mouse carenti in MLKL (mlkl^{- / -} MEFs). NB è un dominio di legame del lipido che coinvolge preferenzialmente il difosfato di fosfatidilinositolo 4,5 del fosfolipide (PIP₂). Abbiamo proposto un meccanismo graduale dell'attivazione di MLKL, in cui parentesi graffa oligomerizzazione facilita il reclutamento di MLKL alla membrana del plasma tramite interazioni deboli di NB con il gruppo di testa polare di₂ PIP²⁴. La membrana, il NB subisce regolamentato l'esposizione di un sito di associazione aggiuntive di alto-affinità per PIP₂, che è mascherato dal tutore in MLKL inattivo. Nel complesso, le interazioni multiple di NB con PIP₂ destabilizzano la membrana plasmatica che porta alla sua rottura, anche se il meccanismo molecolare di questi eventi non sono stati delucidati.

Qui illustriamo metodi specifici utilizzati per caratterizzare la funzione di MLKL come boia di necroptosis²⁴. In particolare, ci concentriamo sul dominio più minimo del MLKL, NB e brace (NBB), che è regolata tramite inibizione di parentesi graffa e può essere attivato attraverso la dimerizzazione forzata per indurre la necroptosis e la rottura della membrana del plasma. Descriviamo il nostro sistema di espressione inducibile combinato con forzata dimerizzazione di FKBP-mediata indotta dai farmaci per l'imaging di cellule vive e la microscopia elettronica delle cellule che subiscono necroptosis. Inoltre, vi illustriamo la nostra analisi in vitro NMR delle interazioni della NBB con phosphatidylinositols (PIPs).

Caratterizzazione della rottura della membrana plasmatica MLKL-mediata in Necroptosis