ネクロトーシスの遺伝的要素を識別する生理・疾患¹^,²^,³^,⁴^,の⁵ネクロトーシスの含意をテストするための動物モデルの使用を促進しています。RIPK3 または MLKL のノックアウトマウスは、そのネクロトーシスは人生³^,⁶の必須ではないことを示唆開発および大人の恒常性で最小限の含意を持っていた。さらに、特定の種は動物⁷^,⁸ネクロトーシスの非本質的な役割をサポート、RIPK3 または MLKL のいずれかの遺伝子を含まない。その一方で、研究室に誘導される様々な病態とノックアウト動物モデルに挑戦、炎症、免疫、ウイルス感染⁹^,¹⁰^,ネクロトーシスの重要な役割が明らかに¹¹^,¹²。

ネクロトーシスは異なる免疫センサー信号によっていくつかの方法で実行されるすべての RIPK3¹^,¹³^,¹⁴の活性化に繋がる。アクティブな RIPK3 化順番 MLKL³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰ ^{をアクティブにし、、}¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸。ほとんどが勉強した、おそらく最も複雑な方法は、RIPK3 の活性化につながる死受容体血管を結紮を分割するか apoptosis かネクロトーシス¹を誘導するシグナル伝達複合体の下流の組成に基づくです。ネクロトーシスはすさまじいが好まれている RIPK1 を介したシグナル伝達機構と RIPK3¹⁹^,²⁰の関与の結果です。この結果は、カスパーゼ 8、ベイでネクロトーシスを保持ネクロトーシスの推定される内因性阻害剤の薬理学的抑制遺伝的削除に簡単に優先されます。RIPK1 に結合し、RIPK3 がアクティブになります。ネクロトーシスをアクティブにする別の方法は、従事し、TIR ドメインを含むアダプター誘導インターフェロン-β (TRIF)²¹を介して RIPK3 をアクティブにする Toll 様受容体 TLR3/TLR4 シグナル伝達を介してです。まだネクロトーシスで死ぬことの別の方法は、直接従事し、RIPK3²²をアクティブに DNA センサー台の活性化です。

MLKL N 末端ヘリックスバンドル (NB) ドメインと規制ブレース地域³によってリンクされている C 末端 pseudokinase ドメイン (psKD) から成る細胞内蛋白質であります。正常細胞の MLKL はどこ RIPK3¹⁴と非アクティブな複合体であると考えられる細胞質にあります。ネクロトーシスの活性化は、psKD、および NB とブレースの³^,¹⁵^,²³で可能性のある追加のサイトの活発化のループの MLKL の RIPK3 のリン酸化をトリガーします。リン酸化は、RIPK3¹⁴から解離による MLKL の構造変化を誘導します。不十分な理解の構造変化は、psKD²⁴からブレースを解放します。2 本のヘリックスが含まれ、ブレースは、C ターミナル螺旋形²⁵推定三量体に MLKL の重合を仲介します。ブレースの N 末端ヘリックスは、膜透過²⁴^,²⁶のために不可欠である NB ドメインを阻害します。分離、NB ドメインは細胞膜透過とネクロトーシス¹⁶^,²⁴^,²⁷を誘導するために十分です。NB の pro necroptotic 活性は、マウス胚性線維芽細胞 (mlkl^-/- MEFs) MLKL 欠損で再構成されました。NB は優先的に従事するリン脂質ホスファチジルイノシトール 4, 5 二リン酸 (PIP₂) 脂質結合ドメインです。ブレース重合が PIP₂極性基²⁴NB の弱い相互作用を介して細胞膜と MLKL の採用を促進する前記 MLKL の活性化の段階的な機構を提案する.膜では、NB は、PIP₂のため非アクティブな MLKL 内のブレースによってマスクされます追加の高親和性結合サイトの規制の露出を経る。全体的にみて、PIP₂と NB の複数の相互作用は、これらのイベントの分子メカニズムが解明されていないが膜の破断につながる不安定します。

ここで我々はネクロトーシス²⁴の死刑執行人として MLKL の機能を特徴付けるために使用する特定のメソッドを示しています。特に、我々は MLKL, NB, ブレース (NBB) ブレース阻害によって規制されており膜破裂とネクロトーシスを誘発する強制二量体化してアクティブになることができますの最も最小限のドメインに焦点を当てます。強制薬物誘発性 FKBP を介した二量体化住セルイメージ投射とネクロトーシスになる細胞の電子顕微鏡観察のために結合した発現システムについて述べる。さらに、NBB フォスファチジルイノシトール (PIPs) との相互作用の in vitro NMR 分析を示す.

これらの方法は、膜転座や脂質結合の透過化などのネクロプトーシスにおける偽キナーゼ混合系統キナーゼドメイン様またはMLKLの役割に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、ネクロプトーシスにおける原形質膜破裂の執行者としてMLKLを直接関与させることです。生細胞イメージングは、特にMLKLを介したネクロプトーシスにおいて、細胞死研究の分野に革命をもたらしました。

核磁気共鳴は、MLKLで実証されているように、タンパク質への脂質結合をモニタリングするための強力な技術です。まず、オリゴマー化カセットとVenusに融合したMLKLの死刑執行ドメインを発現するMLKLノックアウトマウス胚性線維芽細胞またはMEFを、1ミリリットルの補充DMEMに24ウェルプレートで5回10回10回プレーティングし、細胞培養インキュベーターで一晩インキュベートします。翌朝、ドキシサイクリンで細胞を12時間処理して導入遺伝子の発現を誘導し、続いてFK506結合タンパク質二量体化剤と膜不透過性緑色蛍光色素を添加した標準DMEMを添加してネクロプトーシスを誘導します。

細胞死をモニターするには、プレートを哺乳類組織培養インキュベーターに収容された適切なイメージングユニットに置き、イメージングシステムソフトウェアを開きます。「スケジュール・カミング・カッシング・スキャン」タブを選択し、「物理レイアウト」タブでトレイ、容器、スキャン・タイプ、スキャン・パターンを選択します。「Properties」タブで「fast fluorescence」を選択し、「Timeline」ウィンドウをクリックし、取得の時点と頻度の合計数をクリックして、スキャン時間を追加します。

次に、[適用]をクリックして画像取得を開始します。ネクロプトーシスを定量化するには、タスクペインを選択し、マウスカーソルを複数の画像の背景上に置いて、背景レベルより上の固定セグメンテーションしきい値で新しい分析をカウントするオブジェクトを設定します。次に、[プレビュー] を選択して現在の画像内の蛍光オブジェクトを調べ、必要に応じてしきい値レベルを調整します。

閾値の慎重な選択は、プレート上のマルチウェルを観察し、ソフトウェアのプレビュー機能を使用して実行できます。プレート内のすべてのウェルに同じしきい値設定を使用することに注意してください。緑色の蛍光カウントを統合するには、[Launch New Analysis]タブで、分析する時間範囲とウェルを選択し、分析ジョブ名を入力します。

次に、[OK]をクリックし、ジョブ名をダブルクリックして、適切なグラフ作成ソフトウェアプログラムでの追加分析のためにデータをエクスポートします。核磁気共鳴分光法またはNMRによるMLKLの脂質結合には、気密シリンジを使用して、目的のリン脂質1ミリリッ

ネクロトーシス MLKL を介した細胞膜破壊の解析