Necroptosis의 유전자 구성 요소를 식별 생리학과 질병¹^,²^,³^,^,⁴⁵necroptosis의 의미를 테스트 동물 모델의 사용을 촉진 했다. 녹아웃 쥐에 RIPK3 또는 MLKL의 제안 하는 necroptosis는 생활³^,⁶에 대 한 필수적인 개발 및 성인 항상성에서 최소한의 의미를 했다. 또한, 특정 종 동물⁷^,⁸necroptosis의 비 본질적인 역할을 지 원하는 RIPK3 또는 MLKL 유전자를 포함 하지 않습니다. 다른 한편으로, 염증, 타고 난 면제 및 바이러스 감염⁹^,¹⁰^, necroptosis의 중요 한 역할을 계시 했다 다양 한 병 리 실험실에서 유도 된 녹아웃 동물 모델 도전 ¹¹ ^, ¹².

Necroptosis는 여러 가지 방법으로 다른 타고 난 면역 센서를 통해 신호에 의해 활성화 될 수 있다 RIPK3¹^,^,¹³¹⁴의 활성화에 결과의 모든. Active RIPK3에서 phosphorylates 및 MLKL³^,^,⁴⁵^,⁶^,⁷^,^,⁸⁹^,¹⁰ ^{를 활성화}¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,^,¹⁶¹⁷^,¹⁸. 가장 공부 하 고 아마도 가장 복잡 한 방법, RIPK3의 활성화로 이어지는 죽음 수용 체 결 찰, 분기는 apoptosis 또는 necroptosis¹을 유도 하거나 신호 복합물의 다운스트림 구성에 따라 포함 됩니다. Necroptosis 때 RIPK1를 통해 신호 선호 RIPK3¹⁹^,²⁰의 교전에서 결과 인가요. 이 결과 쉽게 약리 억제 또는 caspase 8, 베이에서 necroptosis을 유지 하는 necroptosis의 상 상속 생 억제제의 유전 삭제 시 선호 합니다. RIPK1을 하 고 RIPK3를 활성화 합니다. 또 다른 방법은 necroptosis 활성화 하입니다 수용 체 통행세 같이 TLR3/TLR4 신호, 종사 하 고 유도 하는 어댑터 인터페론-β (TRIF) 사격 도메인 포함²¹를 통해 RIPK3를 활성화. 아직 necroptosis에 의해 죽고 또 다른 방법은 DNA 센서 다이, 직접 종사 하 고 활성화 하는 RIPK3²²의 활성화입니다.

MLKL는 N 맨끝 나선 번들 (NB) 도메인 및 규제 중괄호 지역³로 연결 단자 pseudokinase 도메인 (psKD)의 구성 cytosolic 단백질 이다. 정상 세포에서 MLKL RIPK3¹⁴와 비활성 복잡 한에 생각 된다 cytosol에서 발견 된다. Necroptosis의 활성화는 psKD, 그리고 주의 중괄호³^,^,¹⁵²³에 잠재적으로 추가 사이트의 활성화 루프에서 MLKL의 RIPK3 인 산화를 트리거합니다. 인 산화 MLKL RIPK3¹⁴에서 분리 결과에 구조적 변화를 유도 합니다. 불완전 하 게 이해 구조적 변화 psKD²⁴에서 중괄호를 놓습니다. 2 나선 포함, 중괄호, oligomerization MLKL의 C-터미널 나선²⁵통해 putative 삼합체에 중재. 중괄호의 N 맨끝 나선 막 permeabilization²⁴^,²⁶필수적 이다 NB 도메인 억제. 격리, NB 도메인은 원형질 막 permeabilization와 necroptosis¹⁶^,^,²⁴²⁷유도 충분 합니다. NB의 프로 necroptotic 활동은 마우스 미 발달 섬유 아 세포 MLKL (mlkl^-/- MEFs)의 결핍에서 재구성 된다. NB는 우선적으로 종사 하는 인지질 phosphatidylinositol 4, 5 diphosphate (핍₂) 지질 바인딩 도메인입니다. 우리는 어떤 점에서 중괄호 oligomerization 핍₂ 북극 머리 그룹²⁴NB의 약한 상호 작용을 통해 플라즈마 막에 MLKL의 모집을 용이 하 게 MLKL의 활성화의 stepwise 메커니즘을 제안 했다. 막에서 주의 핍₂는 중괄호 비활성 MLKL에 의해 마스크에 대 한 추가 높은 친 화력 바인딩 사이트의 규제 노출을 겪 습. 이러한 이벤트의 분자 메커니즘 해명 하지는 있지만 전반적으로, 핍₂ NB의 여러 상호 작용 원형질 막의 파열으로 이어지는 불안정.

여기 우리 necroptosis²⁴의 사형 집행으로 MLKL의 기능을 특성화 하는 데 사용 하는 특정 방법을 설명 합니다. 특히, 우리는 MLKL, NB (NBB), 중괄호는 중괄호 억제에 의해 규제 및 적용된 이합체 화 유도 플라즈마 막 파열 및 necroptosis를 통해 활성화 될 수 있다의 가장 최소한의 도메인에 초점. 우리는 우리의 유도할 수 있는 식 시스템 적용된 약물 유발 FKBP 중재 이합체 화 라이브 셀 이미징, 및 necroptosis를 받고 세포의 전자 현미경과 함께 설명 합니다. 또한, 우리 우리의 생체 외에서 NMR 분석을 phosphatidylinositols (PIPs)와 NBB의 상호 작용을 보여 줍니다.

이러한 방법은 막 전좌 및 지질 결합의 투과화와 같은 괴사에서 pseudokinase mixed-lineage kinase-domain like 또는 MLKL의 역할에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 MLKL을 부검사에서 원형질막 파열의 집행자로 직접 연루시킨다는 것입니다. 생세포 이미징은 세포 사멸 연구 분야, 특히 MLKL 매개 괴사증에 혁명을 일으켰습니다.

핵 자기 공명(nuclear magnetic resonance)은 MLKL에 대해 입증된 바와 같이 단백질에 대한 지질 결합을 모니터링하는 강력한 기술입니다. 먼저 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 배양을 위해 올리고머화 카세트에 융합된 MLKL의 executioner domain과 24-well plate에 1ml의 보충된 DMEM에 Venus를 발현하는 네 번째 MLKL 녹아웃 마우스 배아 섬유아세포 또는 MEF에 5회 10회 도금합니다. 다음날 아침, 세포를 독시사이클린으로 12시간 동안 처리하여 전이유전자의 발현을 유도한 다음, FK506 결합 단백질 이합체제와 막 불투과성 녹색 형광 염료가 보충된 표준 DMEM을 첨가하여 괴사를 유도합니다.

세포 사멸을 모니터링하려면 포유류 조직 배양 인큐베이터에 있는 적절한 이미징 장치에 플레이트를 놓고 이미징 시스템 소프트웨어를 엽니다. Schedule Upcoming Scans 탭을 선택하고 Physical Layout 탭에서 트레이, 용기, 스캔 유형 및 스캔 패턴을 선택합니다. Properties 탭에서 fast fluorescence를 선택하고 타임라인 창과 총 시점 및 획득 빈도를 클릭하여 스캔 시간을 추가합니다.

그런 다음 적용을 클릭하여 이미지 획득을 시작합니다. necroptosis를 정량화하려면 작업 창을 선택하고 마우스 커서를 여러 이미지의 배경 위에 올려 놓으면 배경 수준 위의 고정 세분화 임계값으로 개체 계산 새 분석을 설정할 수 있습니다. 그런 다음 Previewing(미리 보기)을 선택하여 현재 이미지에서 형광 물체를 검사하고 필요에 따라 임계값 수준을 미세 조정합니다.

임계값을 신중하게 선택하고 플레이트의 다중 웰을 관찰하고 소프트웨어의 미리보기 기능을 사용하여 수행할 수 있습니다. 플레이트의 모든 웰에 대해 동일한 임계값 설정을 사용해야 합니다. 녹색 형광 수를 통합하려면 Launch New Analysis 탭에서 시간 범위와 분석할 웰을

Necroptosis에서 MLKL-중재 원형질 막 파열의 특성