Identificeren van genetische componenten van necroptosis heeft vergemakkelijkt het gebruik van dierlijke modellen voor het testen van de implicaties van necroptosis in fysiologie en ziekte¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Knock-out van RIPK3 of MLKL in muizen had minimale implicatie in ontwikkeling en volwassene homeostase suggereert dat necroptosis is niet essentieel voor leven³^,⁶. Sommige soorten bevatten bovendien geen RIPK3 of MLKL genen, ter ondersteuning van de niet-essentiële rol van necroptosis in dieren⁷^,⁸. Aan de andere kant, is knock-out diermodellen uitdagend met diverse ziektebeelden geïnduceerd in het laboratorium gebleken dat een belangrijke rol van necroptosis in de ontsteking, aangeboren immuniteit en virale infectie⁹^,¹⁰^, ¹¹ ^, ¹².

Necroptosis kan op verschillende manieren worden geactiveerd door signalering door middel van verschillende aangeboren immuniteit sensoren, al die resulteren in de activering van RIPK3¹^,¹³^,¹⁴. Actieve RIPK3 op zijn beurt kinaseenzym en activeert MLKL³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰ ^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. De meest bestudeerde en wellicht de meest complexe manier, die leiden tot activering van RIPK3 gaat dood receptor afbinding, die bifurcates op basis van de stroomafwaartse samenstelling van de signalering complexen ofwel ertoe apoptosis of necroptosis¹. Necroptosis ontstaat wanneer signalering via RIPK1 is favoriet en in de betrokkenheid van RIPK3¹⁹^,^{20 resulteert}. Dit resultaat is gemakkelijk favoriet bij farmacologische remming of genetische schrapping van caspase 8, een vermeende endogene inhibitor van necroptosis die houdt van necroptosis in het bay. RIPK1 bindt aan en RIPK3 activeert. Een andere manier om te activeren necroptosis is door middel van Toll-like receptoren TLR3/TLR4 signalering, die zich bezighoudt en activeert RIPK3 via TIR-domein-bevattende adapter-inducerende interferon-β (TRIF)²¹. Nog is een andere manier om te sterven door necroptosis door activering van de DNA-sensor DAI, die direct bezighoudt en activeert RIPK3²².

MLKL is een cytosolische eiwit bestaat uit een N-terminal helix bundel (NB)-domein en een C-terminal pseudokinase domein (psKD) door een regelgevende brace regio³met elkaar verbonden. In normale cellen, MLKL gevonden in het cytosol waar het wordt beschouwd als in een inactieve complex met RIPK3¹⁴. Activering van necroptosis activeert fosforylering van de RIPK3 van MLKL in de lus van de activering van de psKD, en potentieel extra sites in de NB en brace³^,¹⁵^,²³. Fosforylering induceert een conformationele verandering in MLKL waardoor de dissociatie van RIPK3¹⁴. Slecht begrepen conformationele wijzigingen laat de brace uit de psKD²⁴. De brace, die 2 helices bevat, bemiddelt oligomerisatie van MLKL in een vermeende trimeer via de C-terminal helix²⁵. De helix van de N-terminal van de brace remt het domein NB, hetgeen essentieel om membraan permeabilization²⁴^,^{26 is}. In isolatie is NB domein voldoende voor het opwekken van plasmamembraan permeabilization en necroptosis¹⁶^,²⁴^,²⁷. De activiteit van de pro-necroptotic voor NB was gereconstitueerd in muis embryonale fibroblasten tekort aan MLKL (mlkl^{- / -} MEFs). NB is een lipide-bindend domein dat netcongestieproblemen de fosfolipide phosphatidylinositol 4,5 (III) difosfaat (PIP_{2 bezighoudt}). Wij hebben voorgesteld een stapsgewijze mechanisme van activering van MLKL, waarin de brace oligomerisatie aanwerving van MLKL naar het plasmamembraan via zwakke interacties voor NB met de PIP₂ polar hoofd groep²⁴vergemakkelijkt. Op het membraan ondergaat de NB gereglementeerde blootstelling van een extra hoge-affiniteit bindende site voor PIP₂, waarin wordt gemaskeerd door de brace in inactieve MLKL. Over het geheel genomen destabiliseren de meerdere interacties van NB met PIP₂ het plasmamembraan leidt tot haar breuk, hoewel het moleculaire mechanisme van deze gebeurtenissen hebben niet is opgehelderd.

We illustreren hier specifieke methoden gebruikt voor het karakteriseren van de functie van MLKL als beul van necroptosis²⁴. In het bijzonder richten we ons op de meest minimale domein van MLKL, de NB en brace (NBB), die wordt gereguleerd door remming van de brace en kan worden geactiveerd door middel van gedwongen dimerisatie ertoe plasmamembraan breuk en necroptosis. Wij beschrijven onze afleidbare expressie systeem gecombineerd met gedwongen drug-geïnduceerde FKBP-gemedieerde dimerisatie voor live-cel beeldvorming, en elektronenmicroscopie van cellen necroptosis ondergaan. Bovendien, illustreren we onze in vitro NMR-analyse van de interacties van de NBB met phosphatidylinositols (pitten).

Karakterisatie van MLKL-gemedieerde plasmamembraan Rupture in Necroptosis