Identyfikacja genetycznych składników nekroptozy ułatwiła wykorzystanie modeli zwierzęcych do testowania wpływu nekroptozy na fizjologię i choroby¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Nokaut RIPK3 lub MLKL u myszy miał minimalny wpływ na rozwój i homeostazę dorosłych, co sugeruje, że nekroptoza nie jest niezbędna do życia³^,⁶. Co więcej, niektóre gatunki nie zawierają ani genów RIPK3, ani MLKL, co potwierdza nieistotną rolę nekroptozy u zwierząt⁷^,⁸. Z drugiej strony, trudne modele zwierzęce z różnymi patologiami wywołanymi w laboratorium ujawniły ważną rolę nekroptozy w stanach zapalnych, odporności wrodzonej i infekcjach wirusowych⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹².

Nekroptoza może być aktywowana na kilka sposobów poprzez sygnalizację za pomocą różnych czujników odporności wrodzonej, z których wszystkie skutkują aktywacją RIPK3¹^,¹³^,¹⁴. Aktywny RIPK3 z kolei fosforyluje i aktywuje MLKL³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Najbardziej zbadany i być może najbardziej złożony sposób prowadzący do aktywacji RIPK3 obejmuje ligację receptora śmierci, która rozdziela się w zależności od dalszego składu kompleksów sygnałowych w celu wywołania apoptozy lub nekroptozy¹. Nekroptoza następuje, gdy sygnalizacja przez RIPK1 jest faworyzowana i powoduje zaangażowanie RIPK3¹⁹^,²⁰. Wynik ten jest łatwo korzystny po farmakologicznym zahamowaniu lub genetycznej delecji kaspazy 8, przypuszczalnego endogennego inhibitora nekroptozy, który utrzymuje nekroptozę na dystans. RIPK1 wiąże się z RIPK3 i aktywuje go. Innym sposobem aktywacji nekroptozy jest sygnalizacja TLR3/TLR4 receptorów Toll-podobnych, która angażuje i aktywuje RIPK3 poprzez infekcję interferonu indukującą β z adapterem (TRIF) zawierającą domenę TIR (TRIF)²¹. Jeszcze innym sposobem na śmierć w wyniku nekroptozy jest aktywacja czujnika DNA DAI, który bezpośrednio angażuje i aktywuje RIPK3²².

MLKL to białko cytozolowe składające się z N-końcowej domeny wiązki helisy (NB) i C-końcowej domeny pseudokinazy (psKD) połączonych regionem nawiasu regulacyjnego³. W normalnych komórkach MLKL znajduje się w cytozolu, gdzie uważa się, że znajduje się w nieaktywnym kompleksie z RIPK3¹⁴. Aktywacja nekroptozy wyzwala fosforylację MLKL RIPK3 w pętli aktywacji psKD i potencjalnie dodatkowych miejscach w klasie NB i brace3^,¹⁵^,²³. Fosforylacja indukuje zmianę konformacyjną w MLKL, która powoduje dysocjację od RIPK3¹⁴. Słabo poznane zmiany konformacyjne zwalniają klamrę z klasy psKD24. Klamra, która zawiera 2 helisy, pośredniczy w oligomeryzacji MLKL w przypuszczalnym trimerze przez C-końcowy helix²⁵. N-końcowa helisa ortezy hamuje domenę NB, która jest niezbędna do przepuszczalności błony²⁴^,²⁶. W izolacji, domena NB jest wystarczająca do wywołania przepuszczalności błony plazmatycznej i nekroptozy¹⁶^,²⁴^,²⁷. Aktywność pronekroptotyczną NB odtworzono w mysich fibroblastach embrionalnych z niedoborem MLKL (mlkl^-/- MEF). NB jest domeną wiążącą lipidy, która preferencyjnie angażuje difosforan fosfolipidu fosfolipidowego fosfatydyloinozytolu (₂). Zaproponowaliśmy krokowy mechanizm aktywacji MLKL, w którym oligomeryzacja klamry ułatwia rekrutację MLKL do błony plazmatycznej poprzez słabe oddziaływania NB z grupą głowy polarnej₂²⁴. Na membranie NB jest poddawany regulowanej ekspozycji dodatkowego miejsca wiązania o wysokim powinowactwie do₂, które jest maskowane przez ortezę w nieaktywnym MLKL. Ogólnie rzecz biorąc, wielokrotne interakcje NB z₂ destabilizują błonę plazmatyczną, prowadząc do jej pęknięcia, chociaż mechanizm molekularny tych zdarzeń nie został wyjaśniony.

Tutaj ilustrujemy konkretne metody używane do scharakteryzowania funkcji MLKL jako wykonawcy nekroptozy²⁴. W szczególności skupiamy się na najbardziej minimalnej domenie MLKL, NB i ortezie (NBB), która jest regulowana przez hamowanie aparatu ortodontycznego i może być aktywowana przez wymuszoną dimeryzację w celu wywołania pęknięcia błony plazmatycznej i nekroptozy. Opisujemy nasz indukowalny system ekspresji w połączeniu z wymuszoną dimeryzacją za pośrednictwem FKBP indukowaną lekiem do obrazowania żywych komórek oraz mikroskopią elektronową komórek poddawanych nekroptozie. Dodatkowo ilustrujemy naszą analizę NMR in vitro interakcji NBB z fosfatydyloinozytolami ().

Charakterystyka pęknięcia błony plazmatycznej za pośrednictwem MLKL w nekroptozie