Identificar componentes genéticos de necroptosis tem facilitado o uso de modelos animais para testar a implicação de necroptosis em fisiologia e doença¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Nocaute de RIPK3 ou MLKL em ratos teve implicação mínima na homeostase desenvolvimento e adulto, sugerindo que necroptosis não é essencial para a vida de³^,⁶. Além disso, certas espécies não contêm genes ou RIPK3 ou MLKL, apoiando o papel de não-essenciais da necroptosis em animais⁷^,⁸. Por outro lado, desafiar modelos animais nocaute com várias patologias induzidas em laboratório revelou um importante papel de necroptosis na inflamação, imunidade inata e infecção viral⁹^,¹⁰^, ¹¹ ^, ¹².

Necroptosis podem ser ativadas de várias maneiras por sinalização através de sensores diferentes imunidade inata, todos que se traduzam na ativação de RIPK3¹^,¹³^,¹⁴. RIPK3 ativo, por sua vez, fosforila e ativa MLKL³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰ ^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. O mais estudado, e talvez a forma mais complexa, levando à ativação de RIPK3 envolve a morte do receptor da ligadura, que bifurca com base na composição a jusante dos complexos sinalização também induzir apoptose ou necroptosis¹. Necroptosis segue-se quando é favorecida e sinalização através de RIPK1 resulta em noivado de RIPK3¹⁹^,²⁰. Este resultado é facilmente favorecido mediante inibição farmacológica ou exclusão genética de caspase 8, um inibidor endógeno putativo de necroptosis que fica necroptosis na baía. RIPK1 liga a e ativa RIPK3. Outra maneira de ativar necroptosis é através de receptores Toll-like TLR3/TLR4 de sinalização, que se envolve e ativa RIPK3 a TIR-domínio-contendo adaptador de indução interferon-β (TRIF)²¹. Ainda outra forma de morrer por necroptosis é pela ativação do sensor DNA DAI, que diretamente se engaja e ativa RIPK3²².

MLKL é uma proteína citosólica, composta de um domínio do N-terminal hélice bundle (NB) e um domínio de pseudokinase C-terminal (psKD) ligados por uma região reguladora chave³. Em células normais, MLKL é encontrado no citosol onde é pensado para ser um complexo inativo com RIPK3¹⁴. Ativação de necroptosis desencadeia fosforilação de RIPK3 de MLKL no loop ativação do psKD e sites potencialmente adicionais no NB e cinta³^,¹⁵^,²³. Fosforilação induz uma mudança conformacional na MLKL que resulta na dissociação do RIPK3¹⁴. Mudanças conformacionais mal-compreendidos liberar a chave do psKD²⁴. A joelheira, que contém 2 hélices, Medeia oligomerização de MLKL em um trímero putativo através do C-terminal hélice²⁵. A hélice do N-terminal do contraventamento inibe o domínio NB, que é essencial para a membrana permeabilização²⁴^,²⁶. Isoladamente, o domínio NB é suficiente para induzir a permeabilização da membrana plasmática e necroptosis¹⁶^,²⁴^,²⁷. A atividade de pro-necroptotic de NB foi reconstituída em fibroblastos embrionários de rato deficientes em MLKL (mlkl^{- / -} MEFs). NB é um domínio de ligação de lipídios que envolve preferencialmente o difosfato de fosfatidilinositol 4,5 de fosfolípidos (PIP₂). Propusemos um mecanismo gradual de ativação do MLKL, no qual cinta oligomerização facilita o recrutamento de MLKL para a membrana plasmática através de interações fracas de NB com o PIP₂ grupo cabeça polar²⁴. Na membrana, o NB sofre exposição regulamentada de um site adicional de alta afinidade de ligação para PIP₂, que é mascarada pelo contraventamento em MLKL inativo. Em geral, as várias interações de NB com PIP₂ desestabilizam a membrana plasmática, levando a sua ruptura, embora o mecanismo molecular desses eventos não ter sido elucidado.

Aqui ilustramos métodos específicos usados para caracterizar a função do MLKL como executor do necroptosis²⁴. Em particular, enfocamos o domínio mínimo do MLKL, NB e cinta (NBB), que é regulada pela inibição de contraventamento e pode ser ativadas através de dimerização forçada para induzir necroptosis e ruptura da membrana plasmática. Nós descrevemos o nosso sistema de expressão inducible combinado com forçada induzido FKBP-mediada dimerização para imagem latente da viver-pilha e microscopia eletrônica de células em fase necroptosis. Além disso, ilustramos nossa análise em vitro NMR das interações do NBB com phosphatidylinositols (PIPs).

Caracterização da ruptura de membrana de Plasma MLKL-mediada em Necroptosis