Определение генетических компонентов necroptosis способствовало использование животных моделей для проверки причастности necroptosis в физиологии и болезни¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Нокаут RIPK3 или MLKL в мышах имеет минимальные последствия развития и взрослого гомеостаза, предполагая, что necroptosis не имеет важное значение для жизни³^,⁶. Кроме того некоторые виды не содержат RIPK3 или MLKL генов, поддерживая роль неосновных necroptosis в животных,⁷^,⁸. С другой стороны сложные нокаут животных моделей с различными патологиями, индуцированной в лаборатории показали важную роль necroptosis в воспаление и врожденный иммунитет, вирусные инфекции⁹^,¹⁰^, ¹¹ ^, ¹².

Necroptosis может быть активирован несколькими способами передачи сигналов через различные врожденного иммунитета датчики, все из которых приводят к активации RIPK3¹^,^,¹³¹⁴. Активные RIPK3 в свою очередь фосфорилирует и активирует MLKL³^,⁴^,⁵^,⁶^,^,⁷⁸^,⁹^,¹⁰ ^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,^,¹⁵¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Наиболее изучены, и возможно наиболее сложные пути, ведущие к активации RIPK3 включает смерть рецептор перевязки, который может разветвлять каждой присваивать по течению состав тонального комплексов либо навести apoptosis или necroptosis¹. Necroptosis наступает при сигнализации через RIPK1 благоприятствования и результаты участия RIPK3¹⁹^,²⁰. Этот результат легко благоприятствования по фармакологическим ингибирования или генетических удаления caspase 8, предполагаемый эндогенных ингибиторов necroptosis, которая держит в страхе necroptosis. RIPK1 связывается и активирует RIPK3. Еще один способ, чтобы активировать necroptosis — через Толл подобные рецепторы TLR3/TLR4 сигнализации, который привлекает и активирует RIPK3 через МДП домен содержащих вызывая адаптер-интерферона β (TRIF)²¹. Еще еще один способ умереть от necroptosis является активация ДНК датчика DAI, который непосредственно занимается и активирует RIPK3²².

MLKL — цитозольной белок состоит из N-терминальный спирали расслоение (NB) домена и домен pseudokinase C-терминал (psKD) соединены регулирования Брейс область³. В нормальных клетках MLKL находится в цитозоле, где он считается неактивного комплекса с RIPK3¹⁴. Активация necroptosis вызывает фосфорилирование RIPK3 MLKL в петле активации psKD, и потенциально дополнительные сайты в NB и фигурная скобка³^,¹⁵^,²³. Фосфорилирование вызывает конформационные изменения в MLKL, что приводит к диссоциации от RIPK3¹⁴. Плохо понимали конформационные изменения версии скобу с psKD²⁴. Брейс, которая содержит 2 спиралей, посредником олигомеризации MLKL в предполагаемый тример через C-терминала спирали²⁵. N-терминальный спирали скобу подавляет NB домен, который имеет важное значение для мембраны permeabilization²⁴^,²⁶. В изоляции NB домен достаточно, чтобы побудить плазматической мембраны permeabilization и necroptosis¹⁶^,²⁴^,²⁷. Про necroptotic активность NB была воссоздана в мыши эмбриональных фибробластов в MLKL (mlkl^{- / -} MEFs). NB — это домен привязки липидов, что преимущественно занимается дифосфат фосфатидилинозитол 4,5 фосфолипидов (пункт₂). Мы предложили поэтапного механизм активации MLKL, в котором Брейс олигомеризации облегчает набор MLKL к плазматической мембране через слабого взаимодействия NB с PIP₂ полярные начальник группы²⁴. В мембраны NB подвергается регулируемого воздействия дополнительного высокоспецифичные связывающие сайта для пункта₂, который замаскированы скобу в неактивных MLKL. В целом несколько взаимодействий NB с PIP₂ дестабилизировать плазматической мембраны, ведущих к ее разрыву, хотя молекулярный механизм этих событий не выяснены.

Здесь мы иллюстрируем конкретные методы, используемые для описания функции MLKL как палач necroptosis²⁴. В частности мы сосредоточены на самых минимальных домен MLKL, NB и фигурной скобкой (НББ), который регулируется Брейс торможение и может быть активировано через насильственных димеризации побудить плазмы плодного и necroptosis. Мы описываем наши системы индуцибельной выражение в сочетании с насильственных наркотиков индуцированной FKBP-опосредованной димеризации для клеток и электронной микроскопии клетки проходят necroptosis. Кроме того мы показываем наши в vitro ЯМР анализ взаимодействия Нацбанка с phosphatidylinositols (PIPs).

Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы о роли псевдокиназы со смешанной линией киназного домена или MLKL в некроптозе, таких как мембранная транслокация и пермеабилизация в связывании липидов. Основное преимущество этих методов заключается в том, что они напрямую вовлекают MLKL в роль исполнителя разрыва плазматической мембраны при некроптозе. Визуализация живых клеток произвела революцию в области исследований клеточной смерти, особенно MLKL-опосредованного некроптоза.

Ядерный магнитный резонанс является мощным методом мониторинга связывания липидов с белками, как показано здесь для MLKL. Начните с нанесения 5 раз по 10 до четвертой нокаутирующей мышиной эмбриональных фибробластов или MEF, экспрессирующих исполнительный домен MLKL, слитых с олигомеризационной кассетой, и Venus в одном миллилитре дополненного DMEM в 24-луночных планшетах для их ночной инкубации в инкубаторе для клеточных культур. На следующее утро обрабатывайте клетки доксициклином в течение 12 часов, чтобы вызвать экспрессию трансгена, с последующим добавлением стандартного DMEM, дополненного димеризатором, связывающим FK506, и непроницаемым для мембран зеленым флуоресцентным красителем для индуцирова

Характеристика MLKL-опосредованной плазматической мембраны разрыв в Necroptosis