Kvantifisering av Hypopigmentation aktivitet i Vitro

Denne metoden kan være nyttig i utviklingen av funksjonell kosmetikk og hudmiddel med anti-melanogene aktiviteter. Det er det å utføre og resultatet kan oppnås raskt. I tillegg kan denne metoden være nyttig for forskere, som ønsker å identifisere eller undersøke effektene eller forbindelsene eller undersøke antimelanogene eller promelanogene aktiviteter.

For å måle til Tyrosinase aktivitet begynne med seeding B16-F10 Melanicides på en fem ganger 10 til fjerde celler per brønn av en 24 brønn plate konsentrasjon i komplett medium i 24 timer i en celle kultur inkubator. Neste dag, erstatte supernatant i hver brønn med DMEM supplert med nylaget test sammensatte og inhibitor kontroll eller en negativ kontroll og returnere platen til inkubatoren i ytterligere 72 timer. På slutten av behandlingen skyll brønnene to ganger med 300 mikroliter kalde pbs per brønn og legg platen på is.

Deretter legger du til 300 mikroliter lysisbuffer til hver brønn ved hjelp av en celleskraper for å samle inn cellelylatene etter fem minutter. Overfør de resulterende cellepartikkelsuspensjonene til individuelle 1,5 milliliter mikrosentride rør. Og homogenisere lysates tre ganger i to sekunder på 14, 500 rpm på is for å frigjøre intercellulær Tyrosinase.

Pellet cellen rusk ved sentrifugering og overføre supernatanter til individuelle 1,5 milliliter sentrifuge rør på is. Tildel 70 mikroliter av hver supernatant til individuelle brønner av en klar 96 brønnpolystyrenmikroplate og tilsett 140 mikroliter tyrosinase substratløsning til hver brønn av supernatant. Rist platen forsiktig for å blande brønninnholdet.

Deretter inkubere platen ved 37 grader celsius i to timer. Og mål til tyrosinaseaktivitet på 475 nanometer på en mikroplateleser. For å måle melanininnholdet i cellene etter å ha samlet lysatet av de behandlede cellene som demonstrert.

Samle lysates ved sentrifugering og overføre supernatanter til nye rør. Tilsett 300 mikroliter av en normal natriumhydroksid til hver pellet i en time inkubasjon ved 60 grader Celsius. Etterfulgt av sentrifugering av oppløste cellesuspensjoner.

Deretter overfører du 200 mikroliter av supernatantene til hver brønn på en 96-brønnplate. Og mål melanininnholdet på en mikroplateleser ved en 400 nanometer bølgelengde. For Fontana-Masson Staining vasker du de behandlede cellene to ganger med 300 mikroliter kalde pbs og fikser cellene med 200 mikroliter på 10% formalin i en time ved fire grader Celsius.

Skyll de tykke cellene med destillert vann og tilsett 200 mikroliter på 58 til 68 grader celsius Ammoniakal sølv arbeidsløsning til hver brønn. I en time inkubasjon ved 37 grader Celsius eller til cellene blir gulbrune i fargen. Skyll de beisede cellene med destillert vann etterfulgt av to minutters inkubasjon i 0,1% gullklorid ved romtemperatur.

Skyll gullkloridbehandlede celler med destillert vann og tilsett 200 mikroliter natriumtosulfatoppløsning til cellene. Etter to minutter skyll cellene igjen. Og merk cellene med 200 mikroliter kjernekraft raskt rødt per brønn i fem minutter.

Vask deretter de beisede cellene med vann fra springen før avbildning under et lett mikroskop. For terskelanalyse åpner du bildene i bilde J og velger bilde, justering og Fargeterskel. For å måle området farget med Fontana Masson sette lysstyrkeparameterlinjen til null og justere lysstyrken til det punktet hvor alle de svarte eller brune beisede cellene er inkludert.

Velg Analyser og analyser partikler, og merk av for summeringsboksen i vinduet Analyser partikler, og klikk deretter greit for å få et sammendrag av resultatene og kopier og lim inn dataene i et regneark. Arbutinbehandling undertrykker tyrosinaseaktiviteten betydelig sammenlignet med kontroll av kjøretøybehandlede celler. Tilsvarende melanin innholdet av celler stimulert med Arbutin er betydelig redusert i forhold til kontrollene.

Selv om cellene er morfologisk lik mellom behandlingsgrupper, reduserer Arbutin området av svart pigment sammenlignet med de kontrollbehandlede cellene. Denne metoden er nyttig for aktiviteter screening ved hjelp av vårt sammensatte bibliotek. Det er over hundrevis av prøver som skal testes raskt.

Videre kan denne metoden også brukes til å undersøke mekanismen som involverer melanogenese. Etter at de bioaktive kandidatene forbindelser har blitt identifisert, for deres vitnesbyrd om studiet av biologiske mekanismer eller kommersielle anvendelser.