Biology
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Saccharomyces cerevisiae श्वसन और Fermentative चयापचय का विश्लेषण करने के लिए बैच संस्कृति में घातीय वृद्धि कैनेटीक्स
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यहां हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान घातीय वृद्धि समीकरण को Saccharomyces cerevisiae की घातीय वृद्धि फिटिंग द्वारा श्वसन और fermentative चयापचय का अनुमान है । काइनेटिक मापदंडों की गणना किण्वन या mitochondrial श्वसन पर पदार्थों/यौगिकों के प्रभाव की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है ।
Transcript
यह विधि जैव प्रौद्योगिकीय और जैव चिकित्सा क्षेत्रों में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है जैसे कि वारबर्ग और क्रैबट्री प्रभावों के पीछे आणविक आधार क्या हैं। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह श्वसन और किण्वित चयापचय में कुछ पदार्थों के प्रभावों के उच्च थ्रूपुट अध्ययन की अनुमति देता है। नकारात्मक 20 डिग्री सेल्सियस पर ग्लिसरोल में संरक्षित एस.सेरेविसियाई खमीर कोशिकाओं के 250 माइक्रोलीटर के साथ, शांत, बाँझ 2% खमीर निकालने पेप्टोन डेक्सट्रोज़, या वाईपीडी शोरबा के तीन मिलीलीटर युक्त एक 15 मिलीलीटर शंकुवाण ट्यूब को इनोक्यूलेट करके शुरू करें।
30 डिग्री सेल्सियस और २०० आरपीएम पर एक कक्षीय शेखर में रात भर खमीर इनक्यूबेट । एक ६०-मिलीलीटर पर लकीर के लिए, 2% YPD आगर से भरा पेट्री पकवान अगली सुबह । संस्कृति 30 डिग्री सेल्सियस पर पकवान जब तक अलग कालोनियों मनाया जाता है ।
फिर एक नई शंकु नली में एक अलग कॉलोनी टीका लगाते हैं जिसमें 10 मिलीलीटर शांत, बाँझ 2% YPD शोरबा रात भर संस्कृति के लिए मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर होता है। माइक्रोप्लेट ग्रोथ-कर्व सेटअप के लिए, एक बाँझ 10-बाय-10 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के प्रत्येक कुएं में एक उपयुक्त प्रयोगात्मक सांस्कृतिक माध्यम के 145 माइक्रोलीटर जोड़ें और प्रत्येक अच्छी तरह से रात की संस्कृति के पांच माइक्रोलीटर के साथ टीका लगाएं। फिर 48 घंटे के लिए 200 आरपीएम पर लगातार आंदोलन के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर एक माइक्रोप्लेट रीडर में बहु अच्छी तरह से प्लेट इनक्यूबेट, 600 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व को मापने हर 30 या 60 मिनट.
हिल शंकु फ्लास्क विकास-वक्र सेटअप के लिए, 20 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम पर इनक्यूबेशन के लिए दो नैनोमीटर में प्री-इनोकुलम संस्कृति के 200 माइक्रोलीटर के साथ एक उपयुक्त बाँझ संस्कृति मीडिया के 4.8 मिलीलीटर युक्त 20 मिलीलीटर टीका लगाते हैं। प्रति मिनट 250 क्रांतियों पर आंदोलन कार्बन स्रोतों की कम सांद्रता में उपयुक्त वृद्धि हासिल करने के लिए महत्वपूर्ण है जो श्वसन विकास को लागू करता है क्योंकि हमने कम आंदोलन की गति से श्वसन की स्थिति में कम खमीर वृद्धि देखी है। 24 घंटे के लिए हर दो घंटे में 600 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व की माप की अनुमति देने के लिए, एक मिलीलीटर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर क्यूवेट में आसुत पानी के 900 माइक्रोलीटर में हिल शंकु फ्लास्क संस्कृति के 100 माइक्रोलीटर को पतला करें और धीरे-धीरे पिपेट द्वारा मिलाएं।
डेटा प्रोसेसिंग के लिए, एक उपयुक्त सांख्यिकीय पैकेज सॉफ्टवेयर में, एक नई परियोजना फ़ाइल बनाएं, नई तालिका और ग्राफ मेनू खोलें, और XY का चयन करें। नमूना डेटा मेनू के तहत, एक खाली डेटा टेबल और एक अंक और कनेक्टिंग लाइन ग्राफ के साथ शुरू का चयन करें। एक्स अनुभाग को प्रतिकृति या त्रुटि मानों के लिए उपकोल्यूल में अचयनित छोड़ दें। वाई अनुभाग में, चयन करें साथ-साथ सबकोल्यूलंस और प्लॉट मतलब और त्रुटि एसडी में 10 दोहराने मूल्यों दर्ज करें । इसके बाद क्रिएट करने पर क्लिक करें।
उस समय दर्ज करें जिस पर एक्स कॉलम में ओडी माप प्राप्त किए गए थे और वाई कॉलम में संस्कृतियों से प्राप्त ओडी मान। वाई कॉलम डेटा को लॉगरिथ्म्स में बदलने के घातीय विकास चरण की पहचान करने के लिए, विश्लेषण पर क्लिक करें और ट्रांसफॉर्म विश्लेषण का चयन करें। वाई मानों का चयन करने और परिणामों की गैलरी खोलने के लिए लॉग वाई के बराबर करें।
ट्रांसफॉर्म डेटा टेबल का चयन करें, विश्लेषण करें, विश्लेषण करें, और ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों को छोड़कर, रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण का चयन करें जो तालिका में मूल्यों का चयन करके और निराशाजनक नियंत्रण और डेटा-टेबल गैलरी E.In करके रैखिक प्रवृत्ति का पालन नहीं करते हैं, डेटा एक तालिका का चयन करें और विश्लेषण करें। विश्लेषण करने के लिए नॉनलाइनर प्रतिगमन वक्र फिट विश्लेषण और डेटा सेट का चयन करें, और ठीक क्लिक करें। फिर डेटा के लिए कम से कम वर्गों को फिट करें, इंटरपोलेट अनुभाग को अचयनित छोड़ दें, और ओके पर क्लिक करें। इसके बाद, एक नई परियोजना फ़ाइल खोलें, और नई तालिका और ग्राफ मेनू में, कॉलम विकल्प का चयन करें, एक खाली डेटा टेबल और वांछित ग्राफ के साथ शुरू करें। मानक विचलन के साथ मतलब को प्लॉट करने के लिए ग्राफ सेट करें, और बनाने पर क्लिक करें।
परिणामों की गैलरी में nonlinear फिट परिणाम तालिका से मतलब या डेल्टा समय मूल्यों की नकल करें और एक कॉलम में डेटा पेस्ट । अंत में, विभिन्न न्यूट्रीमेंटल स्थितियों के गतिज मापदंडों की तुलना करने के लिए कॉलम विश्लेषण मेनू में रुचि के विश्लेषण पर क्लिक करें और चयन करें। विकास गतिज दहलीज मूल्यों ताकत के बीच बदलती है और शर्तों है कि हम विश्लेषण में उपयोग के अनुसार मूल्यांकन किया जाना चाहिए ।
किण्वित फेनोटाइप का प्रदर्शन करने वाली संस्कृतियों में एक छोटा अंतराल चरण और उच्च विकास दर के साथ एक घातीय चरण होता है। मुख्य रूप से ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन द्वारा ऊर्जा प्राप्त करने वाली संस्कृतियां घातीय चरण के दौरान विकास की धीमी दर के साथ लंबे अंतराल चरण का प्रदर्शन करती हैं। विशिष्ट विकास दर की गणना और घातीय विकास समीकरण का उपयोग करके विकास घटता के दोहरीकरण समय श्वसन और किण्वित विकास मूल्यों के लिए थ्रेसहोल्ड की स्थापना के लिए अनुमति देता है।
उदाहरण के लिए, इन प्रतिनिधि प्रयोगों में, S.cerevisiae BY4742 कोशिकाओं पर विभिन्न रेस्वेराट्रोल सांद्रता के प्रभाव अलग-अलग ग्लूकोज सांद्रता के जवाब में कोशिका ऊर्जावान स्थिति के संशोधन को प्रकट करते हैं। यहां, 10% ग्लूकोज के साथ पूरकता दर्शाता है कि अमोनियम की कम सांद्रता किण्वित चयापचय के रूप में इन संस्कृतियों में एक विस्तारित घातीय विकास चरण से सबूत है, जबकि एक उच्च एकाग्रता एक प्रतिप्रसरो-किण्वित चयापचय लाती है जैसा कि एक विस्तारित अंतराल चरण और घातीय चरण के दौरान एक धीमी वृद्धि दर का सबूत है। अंत में, किण्वित दोहरीकरण समय मूल्यों में मजबूत अंतर एक ही शर्तों के तहत उगाया इन दो अलग खमीर उपभेदों के बीच देखा जा सकता है, प्रत्येक तनाव का विश्लेषण के लिए दोहरीकरण समय सीमा को मांय करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला ।
इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग केवल फेनोटाइप को स्क्रीन करने के लिए किया जाता है। श्वसन और किण्वन पर विशिष्ट प्रभावों की पुष्टि ऑक्सीजन की खपत परख या किण्वन उपउत्पादों के संचय द्वारा क्रमशः की जानी चाहिए।
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जीव विज्ञान अंक १३९ Saccharomyces cerevisiae विकास कैनेटीक्स घातीय चरण बैच संस्कृतियों घातीय वृद्धि समीकरण mitochondrial श्वसन किण्वनRelated Videos
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