Saccharomyces cerevisiae Eksponentiell vekst Kinetics i Batch kultur analysere Respiratory og Fermentative metabolisme

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen bioteknologiske og biomedisinske felt som hva som er molekylært grunnlag bak Warburg og Crabtree effekter. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater den høye gjennomstrømningsstudien av effekten av visse stoffer i respiratorisk og fermentativ metabolisme. Begynn med å inokulere et konisk rør på 15 milliliter som inneholder tre milliliter kjølige, sterile 2% gjærekstrakt peptondekstrose, eller YPD kjøttkraft, med 250 mikroliter s.cerevisiae gjærceller bevart i glyserol ved negative 20 grader Celsius.

Inkuber gjæren over natten i en orbital shaker ved 30 grader Celsius og 200 rpm. for striping på en 60-milliliter, 2% YPD agar-fylt Petri parabolen neste morgen. Kultur parabolen på 30 grader Celsius til isolerte kolonier observeres.

Inokuler deretter en enkelt isolert koloni i et nytt konisk rør som inneholder 10 milliliter kjølig, steril 2% YPD kjøttkraft for overnattingskultur ved 30 grader Celsius med risting. For mikroplate vekstkurve oppsett, tilsett 145 mikroliter av en passende eksperimentell kulturell medium til hver brønn av en steril 10-by-10 godt mikroplate med et lokk og inokulerer hver brønn med fem mikroliter av natten kultur. Deretter inkubere multi-brønnplaten i en mikroplateleser ved 30 grader Celsius med konstant agitasjon ved 200 rpm i 48 timer, og måler den optiske tettheten ved 600 nanometer hvert 30 eller 60.

For rystet konisk kolbe vekst-kurve oppsett, inokulerer 20 milliliter koniske flasker som inneholder 4,8 milliliter av en passende steril kultur media med 200 mikroliter pre-inoculum kultur på en 600 nanometer optisk tetthet på to for inkubasjon ved 30 grader Celsius og 250 rpm. Agitasjon ved 250 omdreininger per minutt er avgjørende for å oppnå en passende vekst i lave konsentrasjoner av karbonkilder som utøver respiratorisk vekst som vi har observert en redusert gjærvekst i respiratoriske forhold ved lavere agitasjonshastigheter. For å tillate måling av den optiske tettheten ved 600 nanometer annenhver time i 24 timer, fortynne 100 mikroliter av den ristede koniske kolben kultur i 900 mikroliter destillert vann i en ett milliliter spektrofotometer cuvette og forsiktig blandes med pipette.

For databehandling, i en passende statistisk pakkeprogramvare, opprett en ny prosjektfil, åpne den nye tabell- og grafmenyen og velg XY. Velg Start med en tom datatabell og et punkt og koble til linjediagram under eksempeldatamenyen. La X-delen være umerket i underkolonner for replikeringer eller feilverdier. I Y-delen velger du angi 10 replikere verdier i delkolonner side ved side og plottsnitt og feilSD. Klikk deretter opprett.

Angi tidspunktet da OD-målingene ble innhentet i X-kolonnen og OD-verdiene hentet fra kulturene i Y-kolonnen. Hvis du vil identifisere den eksponentielle vekstfasen som transformerer Y-kolonnedataene til logaritmer, klikker du analyser og velger transformeringsanalysen. Bruk Y er lik logg Y til å velge Y-verdiene og åpne resultatgalleriet.

Velg transformeringsdatatabellen, klikk analyser og velg den lineære regresjonsanalysen, unntatt de optiske tetthetsverdiene som ikke følger en lineær trend, ved å velge verdiene i tabellen og deprimerende kontroll, E.In og velg dataene en tabell og klikk analyser. Velg den ikke-lineære regresjonskurvekoblingskurveen og datasettene som skal analyseres, og klikk OK. Bruk deretter minst firkanter som passer til dataene, slik at interpolate-delen ikke er valgt, og klikker OK. Deretter åpner du en ny prosjektfil, og i den nye tabell- og diagrammenyen velger du kolonnevalget, starter med en tom datatabell og ønsket graf. Angi at diagrammet skal tegne inn gjennomsnittet med standardavviket, og klikk opprett.

Kopier gjennomsnitts- eller deltatidsverdiene fra tabellen for ikke-lineære tilpass resultater i resultatgalleriet, og lim inn dataene i en kolonne. Til slutt klikker du analyser og velger analysen av interesse i kolonneanalysemenyen for å sammenligne de kinetiske parametrene for de forskjellige næringsforholdene. Vekstkinetiske terskelverdier varierer mellom styrker og må evalueres i henhold til forholdene vi bruker i analysen.

Kulturer som viser en fermentativ fenotype har en liten forsinkelsesfase og en eksponentiell fase med høy vekstrate. Kulturer som oppnår energi hovedsakelig ved oksidativ fosforylering, viser en lengre forsinkelsesfase med en langsom veksthastighet i eksponentiell fase. Beregning av den spesifikke veksthastigheten og doblingen av vekstkurvene ved hjelp av eksponentiell vekstligning gir mulighet for innstilling av terskler for respiratoriske og fermentative vekstverdier.

For eksempel, i disse representative eksperimenter, effekten av ulike resveratrol konsentrasjoner på S.cerevisiae BY4742 celler avsløremodifisering av cellen energisk status som svar på varierende glukosekonsentrasjoner. Her viser tilskudd med 10% glukose at lavere konsentrasjoner av ammonium favoriserer fermentativ metabolisme som det fremgår av en utvidet eksponentiell vekstfase i disse kulturene, mens en høyere konsentrasjon induserer en respiro-fermentativ metabolisme som det fremgår av en utvidet forsinkelsesfase og en langsommere vekstrate i eksponentiell fase. Til slutt kan robuste forskjeller i fermentative doblingstidsverdier observeres mellom disse to forskjellige gjærstammene som dyrkes under de samme forholdene, og fremhever nødvendigheten av å validere doblingstidsterskelen for hver belastning som analyseres.

Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske at denne protokollen bare brukes til å screene ut fenotype. De spesifikke effektene på respirasjon og gjæring må bekreftes av oksygenforbruksanalyser eller ved akkumulering av henholdsvis fermenteringsbiprodukter.