Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
선 동적인 장 질병에 방지 접착 치료의 기능 분석에 대 한 동적 접착 시험
Chapters
Summary September 20th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
혈관 벽에 면역 세포의 동적 접착 용기 추적에 대 한 전제 조건입니다. 여기, 우리 addressin 코팅 모 세관을 사용 하 여 인간 세포의 동적 세포 접착에 안티 integrin 항 체, 발산 또는 다른 요인의 영향 분석에 대 한 기능 생체 외에서 시험에 대 한 프로토콜을 제시.
Transcript
이 방법은 말초 기관에 호밍에 필요한 면역 세포의 접착 폭포에 관한 기본적인 면역 생물학 및 염증성 장 질환 연구의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 흐름 조건 하에서 세포 접착의 맥락에서 기능적 질문에 대답하기위한 편리하고 간단한 접근 법이라는 것입니다. 이 방법은 염증성 장 질환에서 세포 푸아화 항-인테그린 항체의 메커니즘을 탐구하기 위해 개발되었지만, 다른 염증성 질환 설정에서 유사한 문제를 분석하도록 수정될 수 있다.
튜브에 약 0.5센티미터 직사각형 모세관의 삽입을 허용하기 위해 작은 가위로 한쪽에 고무 튜브 조각을 스트레칭하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 파라핀 필름과의 연결을 봉인합니다. 관심있는 주소의 20 마이크로 리터로 모세관을 코팅하고 37섭씨에서 적어도 한 시간 동안 플라스틱 파라핀 필름으로 튜브에 연결되지 않은 측면을 밀봉하십시오.
인큐베이션이 끝나면 플라스틱 파라핀 필름을 제거하고 액체가 모세관을 종이 타월에 담그고 튜브를 비웁니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 적어도 한 시간 동안 20 마이크로리터의 블로킹 용액으로 모세관을 차단합니다. 코딩된 단백질의 기능을 손상시킬 수 있으므로 모세관의 건조를 피하기 위해 코팅을 제거한 후 모세관에 직접 차단을 적용하는 것이 매우 중요합니다.
모세관이 막히는 동안, 50 밀리리터 튜브에서 항응성 전체 인간의 혈액 18 밀리리터를 추가하고 PBS를 가진 35 밀리리터의 총 부피로 혈액을 희석시십시오. 층 10 혈액 용액 하에서 밀도 그라데이션 배지의 밀리리터와 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 혈액 세포를 분리한다. 분리의 끝에서, 새로운 50 밀리리터 튜브에 밀도 그라데이션 매체의 인터페이스에서 말초 혈액 단핵 세포를 전송.
그리고 신선한 PBS와 함께 튜브에 최대 50 밀리리터까지 튜브의 총 볼륨을 가져. 원심 분리 후 제조업체의 지침에 따라 적절한 세포 추적 염료로 세포를 계산하고 얼룩지게하기 위해 신선한 PBS의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 분리하십시오. 염색 배큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 세포를 수집하고 완전한 RPMI 중간 농도의 밀리리터 당 6 개의 세포에 1.5 배 10에서 펠릿을 재중단.
그런 다음 조건이있는 48 웰 플레이트의 많은 우물로 세포의 1 밀리리터를 시드합니다. 그리고 섭씨 37도에서 1시간 동안 적절한 우물에 항-인테그린 항체의 적절한 부피를 첨가한다. 다음으로 P1000 파이펫을 사용하여 세포를 여러 번 다시 일시 중지한 후 세포를 개별 2밀리리터 튜브로 옮킨다.
PBS의 1 밀리리터로 각각 잘 헹구고 적절한 2 밀리리터 튜브에 세초를 풀. 계산 후, 원심분리에 의해 세포를 환원하고 밀리리터 현탁액당 제6 세포로부터 1.5배 10배를 얻기 위해 접착 버퍼의 적절한 부피로 세포를 재융자하였다. 그런 다음 각 튜브에 적절한 양의 망간 염화물을 1 밀리머 최종 농도에 추가합니다.
세포가 준비되면 현미경을 켜고 적절한 필터 및 레이저, 목표 및 획득 모드를 선택합니다. 모세관 끝에서 플라스틱 파라핀 필름을 제거하고 가위를 사용하여 5센티미터 길이의 고무 튜브 조각을 늘려 모세혈관이 작은 튜브에 연결되도록 합니다. 플라스틱 파라핀 필름으로 모세관과 튜브 사이의 연결을 밀봉합니다.
그리고 고정 트레이에 모세관을 장착합니다. 모세관이 초점을 맞출 수 있도록 현미경의 트레이 홀더에 트레이를 놓습니다. 그리고 연동 펌프의 해당 노치에 고무 튜브를 삽입합니다.
튜브의 부착되지 않은 끝을 셀 서스펜션을 포함하는 첫 번째 샘플 튜브에 놓습니다. 그리고 모세관의 반대편에 있는 짧은 튜브를 15 밀리리터 튜브에 삽입하여 흐름을 수집합니다. 세포 현탁액이 모세관에 거의 도달할 때까지 분당 500 마이크로리터의 튜브 를 채우게 하십시오.
그런 다음 모세관을 분당 100 마이크로리터의 유량으로 채우게 하십시오. 모세관이 세포로 채워지면 분당 10 마이크로리터로 유량을 조정하고 총 3분 동안 2초마다 우여모를 따라 모세관을 통해 천천히 움직이는 세포의 시간 경과 이미지를 캡처합니다. 세포 현탁액이 모세관 의 내부에 도달하면, 이것은 잠재적으로 측정을 편향 정적 통합 주소로 이어질 수 있기 때문에 흐름의 중단을 방지하는 것이 중요합니다.
폐기하기 전에 현미경의 안장을 통해 전체 모세관을 스트림하여 화면에서 관찰된 섹션이 대표적인지 확인합니다. 펌프에서 튜브를 풀고 나머지 유체가 두 밀리리터 튜브로 다시 실행되도록하십시오. 그런 다음 모세관과 튜빙을 고정 트레이에서 분리하고 방금 설명한 대로 다음 모세관을 이미지합니다.
시간 경과 기록을 평가하려면 적절한 분석 소프트웨어에서 첫 번째 시퀀스를 열고 첫 번째 및 마지막 세 이미지를 TIFF 파일로 내보냅니다. ImageJ에서 세 개의 시작 이미지를 열고 이미지, 유형 및 32비트를 선택하여 이미지를 32비트로 변환합니다. 그런 다음 이미지, 색상 및 병합 채널을 선택하여 이미지를 하나의 이미지로 병합하고 합성 이미지를 RGB로 변환하여 TIFF 파일로 저장합니다.
마지막 세 개의 이미지를 동일한 방식으로 변환한 후 시작 부분에 표시되는 백셀을 계산하고 합성 이미지를 종료합니다. 그리고 엔딩 이미지의 백셀 수로부터 초기 이미지의 백셀 수를 뺍니다. ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1로 코팅된 모세혈관의 관류는 인간 PBMC를 가진 Isotype Fc 키메라가 아닌 세 주소중 하나가 존재할 때 현저한 접착력으로 이어집니다.
대조적으로, 중화 항체를 이용한 인테그린 주소진 상호작용의 억제는 전형적으로 동형 대조군 항체가 첨가될 때 결석하는 동적 접착의 현저한 감소로 이어집니다. 또한, 특정 케모키인을 가진 CD4 인간 T 세포의 치료는 치료되지 않은 인간 세포에 비해 주소로 의 증가된 접착력으로 이어집니다. 이 절차를 시도하는 동안, 다양한 요인이 완전히이 분석에서 다시 할 수없는 생체 내동적 세포 접착에 기여한다는 것을 기억하는 것이 매우 중요합니다.
그러나 매우 복잡한 질문을 해결하기 위해 분석기를 조정할 수 있습니다. 세포 유형 검사의 차동 접착 거동에 대한 추가 질문을 해결하기 위해 다른 세포 추적 염료로 표시된 다른 세포 유형으로 경쟁력 있는 접착 방법을 수행할 수도 있습니다. 개발 후, 이 기술은 우리가 사용 하거나 염증 성 장 질환의 치료를 위한 개발중인 다른 항-integrin 항체의 효과 탐구하는 가능하게 했습니다.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
