Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Rekonstituering i cellen syklus svingninger i mikroemulsjoner Cell-free Xenopus egg ekstrakter
Summary September 27th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi presenterer en metode for generering av i vitro selvbilde vedvarende mitotisk svingninger på encellede nivå ved å innkapsle egg ekstrakter av Xenopus laevis i vann-i-olje mikroemulsjoner.
Transcript
Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i systembiologifeltet, for eksempel reguleringsmekanismen bak det mititotiske nettverket og de dynamiske egenskapene og funksjonene til cellesyklusklokken. Den største fordelen med denne teknikken er at den vil generere en stor mengde dråper med flere cellesykluser i hver, noe som gir oss et rammeverk med høy gjennomstrømning for kvantitativ manipulasjon og analyse. Til å begynne med, kast grupper av egg som har uklare grenser mellom dyre- og vegetale poler eller uregelmessige hvite flekker på toppen av dyrestenger.
Deretter velger du en passende gruppe egg fra en kvinnelig frosk, og overfører eggene til et 600-milliliter beger. Hell ut et overskudd på 0,2x MMR buffer, og legg forsiktig cystein i 1x ekstraktbuffer til eggene. Etter dette rister du begeret kraftig for hånd for å fjerne geléstrøkene på eggene.
Gjenta denne vasken tre ganger med totalt 800 milliliter cysteinbuffer eller til eggene aggregerer og legger seg på bunnen av begeret. Etter at geléfrakken er fjernet, vask eggene fire ganger i en liter 0, 2x MMR-løsning. Bruk en glasspipette til å plukke opp og kaste eggene som blir hvite.
Hell MMR-bufferen ut av begeret, og tilsett 200 milliliter kalsiumionophore-løsning i eggene. Bruk en glasspipette til å røre eggene forsiktig til de er aktivert, og fjern kalsiumionophore-løsningen. Å forlate eggene i kalsiumionophore løsning for lenge vil initiere apoptose.
Vi rører eggene i 1, 5 minutter og kontrollerer aktiveringseffektiviteten. Hvis de ikke er aktivert, gjenopptar du omrøringen og kontrollerer oftere til 90% aktivering er oppnådd. Etter at eggene har lagt seg på bunnen av begeret, kontroller aktiveringseffektiviteten.
Velaktiverte egg har ca. 25% av dyrestangen og 75% av vegetalstangen. Deretter vasker du eggene to ganger med et totalt volum på 50 milliliter ekstraktbuffer supplert med proteasehemmere. Deretter overfører du forsiktig eggene til et 0, 4-milliliter snap-cap mikrorør.
Sentrifuger mikrorøret i 60 sekunder ved 200 g og deretter ved 600 g i 30 sekunder for å pakke eggene. Deretter bruker du et glass Pasteur pipette for å fjerne overflødig buffer på toppen av eggene etter hvert trinn. Etter dette knuser du eggene ved 15.000 g i 10 minutter ved fire grader Celsius.
Bruk et barberblad til å kutte rørene for å skille de tre lagene med knuste egg og holde den grove cytoplasma i det midterste laget. Deretter overfører du den grove cytoplasma til rene ultracentrifuge rør. Supplere cytoplasma med protease hemmere og cytochalasin B på 10 mikrogram per milliliter hver.
Sentrifuger rå cytoplasma på 15,000 g og fire grader Celsius i fem minutter. Deretter bruker du et barberblad til å kutte røret og holde cytoplasma i det midterste laget. Legg de nyberederte ekstraktene på is.
Først legger securin-mCherry mRNA til de tilberedte ekstraktene. Deretter legger du til 200 mikroliter på 2 % PFPE-PEG fluorosurfactant til ekstraktmRNA-blandingen. Bruk en vortex mikser til å generere dråper, justere virvelhastighet og varighet etter behov.
Deretter visuelt inspisere dråpene for å sikre at de er ensartede i størrelse. Bruk en pipette på 200 mikroliter, og overfør dråpene som flyter på toppen og et likt volum av overflateaktivt middel til et PCR-rør. Dypp et glassrør i dråpelaget, og vent til dråpene fyller ca. 75% av røret.
Skyv deretter røret inn i overflateaktivt lag, og fyll røret helt. Fyll deretter en glassbunnet tallerken med mineralolje. Deretter bruker du fine pinsett for å senke dråperøret i oljen.
Bruk en glasspipette til å fjerne synlige rester eller lekkede dråper. For å unngå bevegelse og lekkasje av dråper, bør glassrøret fylt med dråper senkes ned under mineralolje forsiktig. Vi kan enten skyve røret på begge ender med balanse eller legge til noen dråper mineralolje på endene av røret samtidig først.
Etter dette, bruk et epifluorescence mikroskop utstyrt med et motorisert xy stadium for å bilde dråpene. Ta opp tidsforløpsvideoer i det lyse feltet og flere fluorescenskanaler hvert sjette til ni minutter til dråpene mister aktiviteten. Ved hjelp av denne protokollen ble mitotisk oscillasjon i både enkle, kjernefysiske celler og kompliserte celler med kjerner produsert.
De nukleifrie dråpene genererte mitotisk oscillasjon opptil 30 uampede sykluser over 92 timer. Den mititotiske oscillatorens evne til å kjøre nedstrøms mititotiske hendelser ble også undersøkt. Den selvbærende mitotiske oscillatoren drev endringene av kjernefysisk morfologi observert gjennom den autonome endringen av forskjellige cellesyklusfaser.
Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske på tiden når du lager ekstraktet, da det er tidsfølsomt, og alltid holde eggene og trekke ut på is. Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen systembiologi for å utforske grunnleggende prinsipper for komplekse klokkeegenskaper, som tunabilitet og stokastiskhet i Xenopus laevis.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE