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Biochemistry

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无细胞爪卵萃取物微乳液细胞周期振荡的重建

Article doi: 10.3791/58240

September 27th, 2018 •

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本文提出了在油中微乳液中对爪蟾卵提取物进行单细胞水平的体外自持续有丝分裂振荡的生成方法。

该方法有助于回答系统生物学领域中的关键问题，如线粒体网络背后的调节机制以及细胞周期时钟的动态特性和功能。该技术的主要优点是，它将生成大量具有多个细胞周期的液滴，为我们所有人提供定量操作和分析的高通量框架。首先，丢弃动物和植物杆之间界限不清的鸡蛋批次，或在动物杆顶上出现不规则的白点。

接下来，从一只雌性青蛙中选择一批合适的卵子，将卵子转移到600毫升的烧杯中。倒出多余的0.2xMMR缓冲液，并轻轻地将半胱氨酸加入1x提取物缓冲液中。之后，用手大力摇动烧杯，取出鸡蛋的果冻涂层。

重复三次，用总共800毫升的半胱氨酸缓冲液，或直到鸡蛋聚集并沉淀在烧杯的底部。去除果冻涂层后，在一升 0.2 倍 MMR 溶液中清洗鸡蛋四次。使用玻璃移液器拾取并丢弃变白的鸡蛋。

将MMR缓冲液从烧杯中倒出来，将200毫升的钙离子磷溶液加入鸡蛋中。使用玻璃移液器轻轻搅拌鸡蛋，直到它们被激活，并去除钙离子磷溶液。将鸡蛋留在钙离子磷溶液中太久会引发凋亡。

我们搅拌鸡蛋1.5分钟，并检查激活效率。如果未激活，请继续搅拌，并更频繁地检查，直到实现 90% 激活。鸡蛋在烧杯底部沉淀后，检查激活效率。

活性良好的鸡蛋有大约25%的动物杆和75%的植物杆。接下来，用总体积为50毫升的提取物缓冲液洗两次鸡蛋，并辅以蛋白酶抑制剂。然后，小心地将鸡蛋转移到0.4毫升的扣盖微管中。

在200克时将微管离心60秒，然后在600克离心30秒，以包装鸡蛋。然后，使用玻璃巴氏移液器去除鸡蛋顶部的多余的缓冲液后，每一步。之后，在15，000克的鸡蛋中，在4摄氏度下粉碎10分钟。

使用剃刀刀片切割管子，分离三层碎鸡蛋，并保持粗细胞质在中间层。然后，将粗细胞质转移到清洁超离心管。补充细胞质蛋白酶抑制剂和细胞链酶B，每毫升10微克。

将粗细胞质在15，000克和4摄氏度下离心5分钟。然后，使用剃刀刀片切割管子，并保持细胞质在中间层。将新鲜准备好的提取物放在冰上。

首先，在准备好的提取物中加入安全素-mCherry mRNA。接下来，在提取物mRNA混合物中加入200微升2%PFPE-PEG氟化物。使用涡流混合器生成液滴，根据需要调整涡流速度和持续时间。

然后，目视检查液滴，确保液滴的大小均匀。使用 200 微升移液器，将漂浮在顶部的液滴和等量的表面活性剂转移到 PCR 管中。将玻璃管浸入液滴层，等待液滴填充约 75% 的管子。

然后，将管子推入表面活性层，并完全填充管子。接下来，用矿物油填充玻璃底盘。然后，使用细钳子将充满液滴的管子浸入油中。

使用玻璃移液器清除任何可见的碎屑或泄漏的液滴。为避免液滴的移动和泄漏，应小心地将装满液滴的玻璃管浸入矿物油下面。我们可以平衡地将管子推到两端，或者先在管子的两端同时添加几滴矿物油。

在此之后，使用配备电动 xy 舞台的荧光显微镜对液滴进行成像。每六到九分钟录制一次亮场和多个荧光通道中的延时视频，直到液滴失去活动。利用这种协议，在简单、无核的细胞和具有核的复杂细胞中产生了线粒体振荡。

无核液滴在 92 小时内产生长达 30 个未采样的滴位振荡。还研究了线粒体振荡器驱动下游线粒体事件的能力。自我维持的线粒体振荡器通过不同细胞周期阶段的自主变化，推动着核形态的变化。

在尝试此过程时，重要的是要记住制作提取物时的时间，因为它对时间敏感，并且始终将鸡蛋和提取物放在冰上。该技术开发后，为系统生物学领域的研究人员探索复杂时钟特性的原理铺平了道路，如Xenopus laevis的可调性和随机性。

无细胞爪卵萃取物微乳液细胞周期振荡的重建

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