目前心脏组织工程的目标是开发出能够替代或修复受损心肌组织结构与功能的治疗方法1。构建具有天然心脏组织重要收缩性和电生理特性的三维心脏组织模型的方法正在迅速发展2,3。已有多种策略被探索并应用于相关研究4,5，这些方法包括使用特定的合成与天然生物活性水凝胶（如明胶、胶原蛋白、纤维蛋白和多肽）6，以及生物墨水沉积技术2和生物打印技术7。
已有研究表明，无支架方法能够产生与基于生物材料的方法相当的组织，同时避免了引入外源性支架材料所带来的缺点8。Oren Caspi et al. 证明，通过整合多种类型的细胞，可生成高度血管化的人工工程化心肌组织9。Chin et al. 开发了一种利用球状体进行心脏补片3D打印的方法，所获得的补片由心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞按70:15:15的比例组成10。研究表明，球状体作为无支架心肌组织构建的“基本单元”具有显著效果，因其对缺氧具有较强耐受性，并具备足够的机械完整性以满足植入需求11,12。先前的研究已报道了多种球状体的制备方法，包括悬滴法、旋转瓶培养13、微流控系统14，以及使用未包被或包被琼脂糖微模具的非黏附性培养表面15。在本实验方案中，我们采用悬滴装置，该装置含有微孔结构，可同时浓缩数百个球状体。
本研究提出了一种新颖且高效的无支架心肌组织构建方法，该方法包括将球状体手动接种至方形模具腔内，并在摇床中孵育以促进组织成熟。在常规静态培养条件下，氧气扩散仅限于组织结构的外层区域，导致中心部位发生坏死。然而，使用网状模具后，接种于模具内的所有球状体均浸没在培养基中，并处于持续的流体运动状态，从而增强了营养物质和氧气的扩散。此外，这种基于模具的方法能够以最少的人工操作同时制备不同尺寸的组织片，且所得组织可轻松从模具中取出。该创新方法实现了无支架、多层心肌补片的高效且可重复的构建。
本方案描述了一种基于新型简易模具的三维心肌组织构建方法，该方法利用球形细胞聚集体作为无支架心肌组织构建的工具。在我们的实验中，分离并使用了三种细胞：人诱导多能干细胞来源的心肌细胞、人心脏成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞，以制备单细胞悬液。细胞组成为70%心肌细胞、15%成纤维细胞和15%内皮细胞，置于50 mL锥形管中。
随后，我们将细胞悬液分配至超低吸附悬滴系统的每个孔中，三天后可自发形成数百个跳动的球状体。然后收集这些球状体，并将其植入一种新型模具腔内。将组织置于含培养基的无菌容器中，在培养箱内的摇床上维持数天。
随后移除模具，得到具有机械完整性的无支架组织片。悬滴装置是一种可重复使用的超低吸附孔板，含有850个微孔，每个微孔直径为350微米。该悬滴装置与标准六孔板兼容。
制备细胞悬液后，将含有一千万个细胞的四毫升细胞悬液分别加入悬滴系统的每个孔中。将装置置于37°C、5%二氧化碳和95%湿度条件下培养。72小时后，可观察到自发形成搏动的球状体，其平均直径为350微米。
通过将悬滴装置放入另一含有培养基的培养皿中，轻轻旋转以释放类球体，使其从悬滴系统底部的孔隙中漂出，从而收获类球体。这是用于三维、无支架心脏组织构建的新型模具的示意图。该装置包括操作垫、填充底座和新型模具。
该新型模具由一个底座、一个底部方形板、一个底部网片、10层由精细不锈钢齿状结构制成的侧网、一个顶部网片、一个顶部方形板、固定管和止动销组成。该新型模具系统可制备不同尺寸的组织，包括2×2毫米、4×4毫米以及6×6毫米。
使用角柱将底部基底方板和底网堆叠并对齐。然后借助一对无菌镊子，将10层侧网以交替方向堆叠，形成由细小不锈钢针状突起构成的网状结构。接着用1倍磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗填充基底，以降低表面张力，便于将类球体植入新型模具中。
在相同的甲烷中润湿新型模具型腔后，将球状体置入预设的所需尺寸的型腔中。放置后，过量的培养基通过网状模具排出，使球状体充满并形成预定义型腔的形状。然后将顶部网片和顶方板组装到角柱、止动销上，并固定夹持管，以防止球状体被冲出。
将填充好的新型模具系统转移至六孔板中，加入6毫米的B-27添加培养基，然后置于摇床上的培养箱中，在30至40 RPM条件下培养7至10天。培养时间可根据心肌补片的大小进行调整。培养结束后取出系统，移除固定管、塞子、顶部方形板和顶部网筛。
然后逐一小心地滑出分层的侧网，注意不要破坏组织。在移除所有侧网后，可在底部网的上方获得一个完整的心肌补片。24小时内可观察到功能性同步搏动。
这种基于新型模具的方法是一种高效且简便的三维无支架心脏组织构建技术，所需人工操作极少。所获得的多层组织由融合的球状体构成，具有良好的结构完整性和同步搏动行为。该基于模具的创新方法为现有工程化组织的生物制造技术提供了一种成本低、可扩展的替代方案。