Das Ziel des aktuellen Herzgewebe Engineering ist, eine Therapie zu ersetzen oder zu reparieren, die Struktur und Funktion des verletzten Herzmuskelgewebe1zu entwickeln. Methoden zum Erstellen von 3-d-Herzgewebe Modelle präsentiert die wichtigeren kontraktilen und elektrophysiologischen Eigenschaften des nativen Herzgewebe haben2,3rasch ausgedehnt. Eine Vielzahl von Strategien haben erforscht und in Studien4,5verwendet worden. Diese Methoden reichen von den Einsatz von speziellen synthetischen und natürlichen bioaktiven Hydrogele, wie Gelatine, Kollagen, Fibrin und Peptide6, auf Bio-Tinte Ablagerung Technologien2 und Bioprinting Technologien7.
Es hat sich gezeigt, dass Gerüst-freie Methoden als Biomaterial-basierte Methoden, ohne die Nachteile der Einbeziehung ausländischer Gerüst Material8vergleichbare Gewebe produzieren können. Oren Caspi Et Al. zeigten, dass die Einbeziehung der verschiedenen Arten von Zellen die Generation stark vaskularisierte menschlichen entwickelt Herzgewebe9ermöglicht. Kinn Et Al. entwickelt eine 3-d-Druckverfahren für kardiale Patch Kreation aus Sphäroide. Daraus resultierende Patches bestehen aus Herzzellen, Fibroblasten und Endothelzellen in einem 70:15:15 Verhältnis10. Sphäroide nachweislich wirksame "Bausteine" der Gerüst-freie Herzgewebe Schöpfung, wie sie sind resistent gegen Hypoxie und verfügen über ausreichende mechanische Integrität für Implantation11,12. Frühere Studien haben gezeigt, verschiedene Herstellungsmethoden für Sphäroid Schöpfung, einschließlich der Verwendungdes der hängenden drop-Methode, Spinner Fläschchen13, mikrofluidische Systeme14und nicht anhaftende Kultur Oberflächen unbeschichtet oder beschichtet mit Agarose Mikro-Gußformen15. In diesem Protokoll verwenden wir die hängenden Tropfen Gerät, enthält Mikroporen für Hunderte von Sphäroide gleichzeitig kondensiert.
Diese Studie stellt eine neuartige und effiziente Gerüst-freie Methode für Herzgewebe Erstellung, manuell die Sphäroide in einen quadratischen Formhohlraum Aussaat und Inkubation des Gewebes auf einen Shaker für Reifung. Unter üblichen statischen Kulturbedingungen ist Sauerstoffdiffusion beschränkt sich auf die äußeren Aspekte der Gewebe-Konstrukt, was zentrale Nekrose. Mit der net Form Tauchen alle Sphäroide ausgesät in die Form jedoch in Medien mit einer Konstanten fluidische Bewegung, so dass für die verstärkte Verbreitung von Nährstoffen und Sauerstoff. Darüber hinaus diese Form-basierte Methode ermöglicht die gleichzeitige Erstellung von unterschiedlich großen Gewebe Patches mit minimalem manuellen Aufwand und das resultierende Gewebe kann leicht aus der Form entfernt werden. Diese neuartige Methode ermöglicht die effiziente und reproduzierbare Erstellung von Gerüst-frei, vielschichtigen kardiale Patches.
Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige und einfache schimmelbasierte Methode zur dreidimensionalen Erzeugung von Herzgewebe, bei der Sphäroide als Werkzeug für die Herstellung von gerüstfreiem Herzgewebe verwendet werden. In unseren Experimenten wurden drei Zelltypen, humane induzierte pluripotente Stammzellabgeleitete Kardiomyozyten, humane Herzfibroblasten und humane Nabelvenendothelzellen, isoliert und zur Erzeugung einer Zellsuspension verwendet. Mit 70 % Kardiomyozyten, 15 % Fibroblasten und 15 % Endothelzellen in einem konischen 50-ml-Röhrchen.
Anschließend dosieren wir die Zellsuspension in jede Vertiefung eines Hanging Drop-Systems mit extrem geringer Anhaftung, was nach drei Tagen zur spontanen Bildung von Hunderten von schlagenden Sphäroiden führt. Die Sphäroide werden dann geerntet und in einen neuartigen Formhohlraum gesetzt. Das Gewebe wird dann in einem sterilen Behälter mit Medium auf einem Schüttler im Inkubator für mehrere Tage aufbewahrt.
Die Form wird anschließend entfernt, was zu einem gerüstfreien Gewebepflaster mit mechanischer Integrität führt. Die hängende Fallvorrichtung ist eine wiederverwendbare, extrem niedrige Befestigungswanne mit 850 Mikroporen mit