Celem obecnej inżynierii tkankowej serca jest opracowanie terapii zastępującej lub naprawiającej strukturę i funkcję uszkodzonej tkanki mięśnia sercowego1. Metody tworzenia trójwymiarowych modeli tkanki serca wykazujących ważne właściwości kurczliwe i elektrofizjologiczne natywnej tkanki serca szybko się rozwijają2,3. W badaniach zbadano i wykorzystano różne strategie4,5. Metody te obejmują zarówno stosowanie specyficznych syntetycznych i naturalnych bioaktywnych hydrożeli, takich jak żelatyna, kolagen, fibryna i peptydy6, po technologie osadzania biotuszem2 i technologie biodruku7.
Wykazano, że metody bez rusztowań mogą wytwarzać porównywalne tkanki jak metody oparte na biomateriale, bez wad związanych z włączaniem obcego materiału rusztowania8. Oren Caspi i wsp. wykazali, że inkorporacja różnych typów komórek umożliwia generowanie wysoce unaczynionej ludzkiej tkanki serca zaprojektowanej przez człowieka9. Chin i in. opracowali metodę druku 3D do tworzenia łat sercowych ze sferoid. Powstałe plastry składają się z kardiomiocytów, fibroblastów i komórek śródbłonka w stosunku 70:15:1510. Wykazano, że sferoidy są skutecznymi "elementami budulcowymi" w tworzeniu tkanki serca bez rusztowań, ponieważ są odporne na niedotlenienie i mają wystarczającą integralność mechaniczną do implantacji11,12. Wcześniejsze badania wykazały kilka metod wytwarzania sferoidów, w tym zastosowanie metody wiszącej kropli, kolb przędzarki13, systemy mikroprzepływowe14 oraz nieprzylegające powierzchnie hodowlane niepokryte lub pokryte mikropleśniami agarozowymi15. W tym protokole używamy urządzenia do zawieszania kropli, które zawiera mikropory do kondensacji setek sferoid jednocześnie.
To badanie przedstawia nowatorską i efektywną metodę tworzenia tkanki sercowej bez rusztowań, która obejmuje ręczne umieszczanie sferoid w kwadratowej jamie formy i inkubację tkanki na wytrząsarce w celu dojrzewania. W zwykłych warunkach hodowli statycznej dyfuzja tlenu jest ograniczona do zewnętrznych aspektów konstruktu tkankowego, co prowadzi do martwicy centralnej. Jednak w przypadku formy siatkowej wszystkie sferoidy osadzone w formie są zanurzane w mediach o stałym ruchu płynnym, co pozwala na zwiększoną dyfuzję składników odżywczych i tlenu. Dodatkowo ta metoda oparta na formie pozwala na jednoczesne tworzenie plastrów tkankowych o różnej wielkości przy minimalnym wysiłku ręcznym, a powstałą tkankę można łatwo usunąć z formy. Ta nowatorska metoda pozwala na wydajne i powtarzalne tworzenie wielowarstwowych plastrów serca bez rusztowań.
Protokół ten opisuje nowatorską i łatwą metodę tworzenia trójwymiarowej tkanki serca opartą na formie, która wykorzystuje sferoidy jako narzędzie do tworzenia tkanki serca bez rusztowania. W naszych eksperymentach wyizolowano trzy typy komórek, ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych, ludzkie fibroblasty serca i ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej i wykorzystano je do wytworzenia zawiesiny komórkowej. Z 70% kardiomiocytami, 15% fibroblastami i 15% komórkami śródbłonka w stożkowej tubie o pojemności 50 ml.
Następnie dozujemy zawiesinę komórek do każdej studzienki systemu wiszących kropli o bardzo niskim nasadce, co spowoduje spontaniczne uformowanie się setek bijących sferoid po trzech dniach. Sferoidy są następnie zbierane i umieszczane w nowej jamie pleśni. Tkanka jest następnie przechowywana w sterylnym pojemniku z pożywką, na wytrząsarce w inkubatorze przez kilka dni.
Pleśń jest następnie usuwana, w wyniku czego powstaje łata tkankowa wolna od rusztowań o integralności mechanicznej. Wiszące urządzenie upuszczające to wielokrotnego użytku, ultra niska studnia z 850 mikroporami, każdy o średnicy 350 mikronów. Wisząca kropla jest k