O objetivo da engenharia de tecido cardíaco atual é desenvolver uma terapia para substituir ou reparar a estrutura e função do tecido lesado do miocárdio1. Métodos para criar modelos 3D de tecido cardíaco, exibindo as propriedades contráteis e eletrofisiológicas importantes do tecido cardíaco nativo tem sido rápida expansão2,3. Uma variedade de estratégias foram explorados e utilizados em estudos de4,5. Esses métodos variam o uso do específico hidrogel bioativos naturais e sintéticas, tais como gelatina, colágeno, fibrina e peptídeos6, a bio-tinta deposição tecnologias2 e bioprinting tecnologias7.
Ficou demonstrado que métodos livre de andaime podem produzir tecidos comparáveis como métodos baseados em biomateriais, sem os inconvenientes de incorporação de material estrangeiro andaimes8. Oren Caspi et al demonstraram que a incorporação de vários tipos de células permite a geração de tecido cardíaco engenharia humano altamente vascularizado9. Chin et al desenvolveram um método de impressão 3D para criação de remendo cardíaca de esferoides. Resultante de patches são compostas de cardiomyocytes, fibroblastos e células endoteliais em uma relação de 70:15:1510. Esferoides foram mostrados para ser eficazes "blocos de construção" da criação de tecido cardíaco andaime-livre, como eles são resistentes contra hipóxia e possuem integridade mecânica suficiente para implantação de11,12. Estudos anteriores têm demonstrado vários métodos de fabricação para criação de esferoide, incluindo o uso do enforcamento soltar método, girador frascos13, microfluidic sistemas14e superfícies não-aderente cultura não revestidos ou revestidos com micromoldes de agarose15. Neste protocolo, usamos o enforcamento gota dispositivo, que contém microporos para centenas de esferoides de condensação de uma só vez.
Este estudo apresenta uma nova e eficiente método de andaime-livre para a criação de tecido cardíaco, que inclui a semeadura manualmente os esferoides em uma cavidade do molde quadrado e incubando o tecido num agitador para maturação. Em condições habituais de cultura estática, difusão de oxigênio é limitada aos aspectos exteriores da construção de tecido, resultando em necrose central. No entanto, com o molde líquido, todos os esferoides semeados no molde estão imersos na mídia com um constante movimento fluídico, permitindo a maior difusão de nutrientes e oxigênio. Além disso, este método baseado em molde permite a criação simultânea de patches de tecido de diferentes tamanhos, com o mínimo de esforço manual e o tecido resultante pode ser facilmente removido do molde. Este novo método permite a criação eficiente e reprodutível de patches cardíacas andaime-livre, em várias camadas.
Este protocolo descreve um método novo e fácil baseado em molde para a criação de tecido cardíaco tridimensional, que usa esferoides como uma ferramenta para a criação de tecido cardíaco livre de andaimes. Em nossos experimentos, três tipos de células, cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, fibroblastos cardíacos humanos e células endoteliais da veia umbilical humana foram isolados e usados para gerar uma suspensão celular. Com 70% de cardiomiócitos, 15% de fibroblastos e 15% de células endoteliais, em tubo cônico de 50ML.
Em seguida, dispensamos a suspensão celular em cada poço de um sistema de gota suspensa de fixação ultrabaixa, o que resultará na formação espontânea de centenas de esferóides batendo após três dias. Os esferóides são então colhidos e assentados em uma nova cavidade de molde. O tecido é então mantido em um recipiente estéril com meio, em um agitador na incubadora por vários dias.
O molde é posteriormente removido, resultando em um remendo de tecido livre de andaimes com integridade mecânica. O dispositivo de gota suspensa é um poço de fixação ultra baixo reutilizável com 850 microporos, cada um com um diâmetro de 350 mícrons