直到最近，脂肪组织一直被认为是一团无定形的脂肪细胞。在过去的几十年中，我们对脂肪组织的认识逐渐深入，现在已认识到脂肪组织是一个复杂的器官，包含不同类型的脂肪细胞，以及脂肪细胞前体、免疫细胞、成纤维细胞、血管系统和神经突起。这些驻留于脂肪组织中的细胞之间的相互作用，对脂肪组织乃至整个机体的生理和病理生理过程具有显著影响1。尽管新兴研究已揭示了某些细胞间相互作用背后的重要分子机制，但要获得更全面的理解，仍需要对整个组织进行可靠的三维（3D）结构解析。
目前对脂肪组织形态学的认识在很大程度上依赖于对薄切片（5 μm）进行相对高倍成像（超过10X）的组织学分析2,3。然而，这种方法存在若干显著局限性。首先，已知在脂肪组织功能中发挥重要作用的复杂丝状结构，如交感神经和血管系统4,5,6,7，难以通过薄切片进行有效评估。其次，由于脂肪组织外形看似无定形，且缺乏可用于聚焦的代表性结构单元，仅依靠切片染色难以全面理解其组织结构。第三，脂肪组织含有极高的脂质成分，这给获取适用于三维解剖重建的连续切片带来了挑战；而三维解剖重建是研究全脑形态的常规方法8。鉴于上述因素，迫切需要一种整体染色方法，能够在实现细胞分辨率的同时，对整个脂肪组织库进行三维可视化观察。
对整个器官进行三维体积成像由于光散射的遮蔽效应而具有挑战性。生物组织中光散射的主要来源之一是脂质-水界面。尽管通过去除脂质来消除散射的努力已持续了一个多世纪，但近年来出现了大量创新9。其中一种新近开发的组织透明化方法是溶剂清除器官的免疫标记辅助三维成像（iDISCO/iDISCO+）10,11。然而，脂肪组织因其富含脂质而构成特殊挑战，因此需要对iDISCO/iDISCO+方案进行额外修改，以在防止组织塌陷的同时充分提取脂质。我们开发的这一改进方案现称为Adipo-Clear，采用基于甲醇/二氯甲烷的脂肪组织去脂化方法，实现适合高分辨率体积成像的最佳透明度12。由于去脂步骤会显著淬灭内源性表达的荧光蛋白（如GFP和RFP），此类蛋白的可视化必须通过免疫标记来实现。总体而言，这一简单且稳健的方案可用于研究脂肪组织中定居细胞的组织水平结构、脂肪细胞前体细胞的谱系示踪以及发育过程中的脂肪组织形态发生。
该方法有助于解答脂肪组织生物学领域中的关键问题，例如脂肪组织的不同组分在完整组织中如何相互作用。该技术的主要优势在于，能够在维持脂肪组织三维结构的同时，完全去除其中储存的过量脂质。该方法不仅能揭示脂肪组织的三维空间组织特征，还可广泛应用于其他富含脂质的组织，如乳腺和淋巴结。
该方法的可视化演示至关重要，因为脱脂和透明化步骤需要足够的孵育时间，而这一时间往往难以确定。首先，使用平头镊子从新鲜灌注的动物模型中分离出目标脂肪垫。在操作过程中，应小心地完整去除整个脂肪垫，避免夹捏或挤压组织，同时防止毛发污染已分离的组织。
将脂肪垫置于含有约10毫升固定液的15毫升锥形管中，在4摄氏度下后固定过夜。次日用PBS洗涤样本后，在解剖显微镜下小心去除样本上的任何碎片。附着在样本上的毛发、绒毛或其他碎屑会在成像过程中产生阴影。
将洁净的样品转移至含有预冷的20%甲醇B1N缓冲液的聚丙烯管中。将装有样品的管子水平放置于旋转摇床，设置转速为100 RPM，根据样品大小振荡30分钟至1小时。确保样品在管内可自由移动。
使用B1N缓冲液中梯度浓度的40%、60%和80%甲醇溶液继续对样品进行脱水，随后使用100%甲醇。尽量减少溶液的残留转移。脱水完成后，将100%甲醇溶液替换为100%二氯甲烷（DCM）以对样品进行脱脂。
按照表2中列出的孵育时间重复洗涤两次。在第二次和第三次二氯甲烷（DCM）洗涤结束后，样品应沉降至试管底部。若未沉降，应延长孵育时间以确保完全脱脂。
脱脂后，用100%甲醇洗涤两次，每次洗涤时间见表2。随后按照表2所示时间，使用逆向甲醇B1N缓冲液系列对样本进行再水化。再水化完成后，在室温下用PTXWH缓冲液洗涤样本2小时。
样品现在可用于免疫染色，或可在 PTXWH 缓冲液中于 4 摄氏度保存长达 1 年。首先，用 PTXWH 缓冲液将一抗稀释至推荐浓度。然后，将稀释后的一抗溶液在 20,000 ×g 离心 10 分钟，以防止引入抗体沉淀或聚集体。
选择能够耐受甲醇和二氯甲烷（DCM）处理的合适一抗非常重要。新抗体应使用小块组织或经甲醇处理的组织切片进行验证。根据样本大小，将脱脂后的样本在一抗溶液中孵育3至5天。
一次孵育后，用多份PTXWH缓冲液洗涤样本。次日，将二抗用PTXWH缓冲液稀释至推荐浓度。同前次一样，离心稀释后的抗体溶液。
根据样本大小，将样本与二抗溶液孵育3至5天。再次按照之前的方法，用PTXWH缓冲液通过一系列孵育步骤清洗样本。次日，依次用1×PBS清洗样本，分别为5分钟、10分钟和30分钟。
将脂肪组织包埋于琼脂糖中，以方便在光片显微镜下进行样本固定。首先，用1%琼脂糖溶于1×PBS中制备包埋液。将包埋液冷却至约40摄氏度，以避免样本暴露于过高温度下。
避免液体携带污染，将清洗后的组织样本放入模具中，并调整至所需位置。然后轻轻将包埋液倒入样本上，注意避免产生气泡。在琼脂