Adipo-Clear: Een weefsel Clearing methode voor driedimensionale beeldvorming van vetweefsel

Tot voor kort werd adipeus weefsel opgevat als een amorfe verzameling van vetcellen. In de afgelopen decennia, is ons begrip meer verfijnd, gegroeid met vet nu erkend als een complex orgaan met verschillende soorten adipocytes, evenals adipocyte precursoren, immune cellen, fibroblasten, de therapieën en zenuw projecties. Interacties tussen deze cellen adipeus-ingezeten hebben uitgesproken effecten op vetweefsel en organisch fysiologie en pathofysiologie¹. Hoewel opkomende studies hebben ontrafeld belangrijke moleculaire mechanismen ten grondslag liggen aan bepaalde interacties, vereist een vollediger begrip betrouwbare structurele profilering van het hele weefsel in drie dimensies (3D).

Onze huidige kennis van vetweefsel morfologie is grotendeels gebaseerd op histologische analyse van dunne secties (5 μm) met relatief hoge-vergroting beeldvorming (meer dan 10 X)^2,3. Deze benadering heeft echter enkele belangrijke beperkingen. Eerste, ingewikkelde filamenteuze structuren zoals sympathische zenuwen en de therapieën, waarvan bekend is dat een belangrijke rol spelen in de obesitas functie^4,,^5,,^6,7, zijn moeilijk te evalueren via de dunne secties. Ten tweede, vanwege zijn schijnbaar amorfe vorm en het gebrek aan representatieve structurele eenheden te concentreren op, het is moeilijk te waarderen adipeus weefsel structuren alleen gebaseerd op sectie kleuring. Ten derde, vetweefsel heeft een zeer hoog vetgehalte, maken van de uitdagingen bij het verkrijgen van consistente seriële secties die geschikt voor 3D anatomische reconstructie, een conventionele methode gebruikt zijn bij het bestuderen van de hele hersenen morfologie⁸. Gezien deze factoren, is er een grote behoefte aan een geheel-mount aanpak die 3D visualisatie van een hele obesitas depot terwijl nog het bereiken van cellulaire resolutie kan bieden.

3D volumetrische beeldvorming van een gehele orgaan is uitdagend vanwege de verduistert effecten van licht spreiding. Een belangrijke bron van licht spreiding in biologische weefsels komt van lipide-waterige interfaces. Hoewel de inspanningen om te elimineren scatter doordat lipiden lopende voor meer dan een eeuw geweest, zijn er een groot aantal recente innovaties⁹. Een dergelijk nieuw ontwikkelde weefsel-clearing methode is immunolabeling ingeschakelde 3D beeldvorming van oplosmiddel-gewist organen (iDISCO / iDISCO +)^10,11. Vetweefsel kampt echter met een bijzondere uitdaging, gezien zijn hoge niveau van lipiden, en daarom extra wijzigingen in de iDISCO / iDISCO + protocol moeten volledig uittreksel van de lipiden terwijl de bescherming van het weefsel instort. Het gewijzigde protocol die we hebben ontwikkeld, nu genaamd Adipo-Clear, maakt gebruik van methanol/dichloormethaan gebaseerde delipidation van vetweefsel aan het bereiken van optimale transparantie geschikt voor hoge resolutie volumetrische imaging¹². Want de delipidation stap grotendeels lest endogeen uitgedrukt fluorescente proteïnen zoals GFP en RFP, moet visualisatie van dergelijke eiwitten worden bereikt door immunolabeling. Globaal, dit eenvoudig en robuust protocol kan worden toegepast om te bestuderen van weefsel-niveau organisatie van adipeus-ingezeten cellen, lineage traceren van adipocyte voorlopercellen, en obesitas morfogenese tijdens de ontwikkeling.