Adipo-Clear: metoda oczyszczania tkanek do trójwymiarowego obrazowania tkanki tłuszczowej

Do niedawna tkanka tłuszczowa była postrzegana jako amorficzny zbiór komórek tłuszczowych. W ciągu ostatnich kilku dekad nasze zrozumienie stało się bardziej wyrafinowane, a tłuszcz jest obecnie uznawany za złożony narząd zawierający różne typy adipocytów, a także prekursory adipocytów, komórki odpornościowe, fibroblasty, naczynia krwionośne i projekcje nerwowe. Interakcje między tymi komórkami rezydującymi w tkance tłuszczowej mają wyraźny wpływ na tkankę tłuszczową oraz fizjologię i patofizjologię organizmu¹. Chociaż nowe badania ujawniły ważne mechanizmy molekularne leżące u podstaw niektórych interakcji, bardziej wszechstronne zrozumienie wymaga wiarygodnego profilowania strukturalnego całej tkanki w trzech wymiarach (3D).

Nasza obecna wiedza na temat morfologii tkanki tłuszczowej opiera się głównie na analizie histologicznej cienkich odcinków (5 μm) ze stosunkowo dużym powiększeniem obrazowania (ponad 10X)^2,3. Takie podejście ma jednak kilka istotnych ograniczeń. Po pierwsze, skomplikowane struktury nitkowate, takie jak nerwy współczulne i układ krążenia, o których wiadomo, że odgrywają ważną rolę w funkcjonowaniu tkanki tłuszczowej^4,5,6,7, są trudne do oceny za pomocą cienkich przekrojów. Po drugie, ze względu na pozornie amorficzny kształt i brak reprezentatywnych jednostek strukturalnych, na których można by się skupić, trudno jest docenić struktury tkanki tłuszczowej wyłącznie na podstawie barwienia przekrojowego. Po trzecie, tkanka tłuszczowa ma bardzo wysoką zawartość lipidów, co stwarza wyzwania w uzyskaniu spójnych odcinków seryjnych, które są odpowiednie do rekonstrukcji anatomicznej 3D, konwencjonalnej metody stosowanej do badania morfologii całego mózgu⁸. Biorąc pod uwagę te czynniki, istnieje ogromne zapotrzebowanie na kompleksowe podejście, które może zapewnić wizualizację 3D całego magazynu tłuszczu przy jednoczesnym osiągnięciu rozdzielczości komórkowej.

3D wolumetryczne obrazowanie całego narządu jest trudne ze względu na zasłaniające efekty rozpraszania światła. Głównym źródłem rozpraszania światła w tkankach biologicznych są granice faz lipidowo-wodnych. Chociaż wysiłki mające na celu wyeliminowanie rozproszenia poprzez usunięcie lipidów trwają od ponad wieku, w ostatnim czasie pojawiło się wiele innowacji⁹. Jedną z takich nowo opracowanych metod oczyszczania tkanek jest obrazowanie 3D narządów oczyszczonych rozpuszczalnikiem z wykorzystaniem znakowania immunologicznego (iDISCO/iDISCO+)^10,11. Jednak tkanka tłuszczowa stanowi szczególne wyzwanie ze względu na wysoki poziom lipidów, dlatego wymagane są dodatkowe modyfikacje protokołu iDISCO/iDISCO+, aby w pełni wydobyć lipidy, jednocześnie chroniąc tkankę przed zapadnięciem się. Opracowany przez nas zmodyfikowany protokół, obecnie nazywany Adipo-Clear, wykorzystuje delipidację tkanki tłuszczowej na bazie metanolu/dichlorometanu w celu uzyskania optymalnej przezroczystości odpowiedniej dla obrazowania wolumetrycznego o wysokiej rozdzielczości¹². Ponieważ etap delipidacji w dużej mierze wygasza endogenne białka fluorescencyjne, takie jak GFP i RFP, wizualizacja takich białek musi być osiągnięta przez znakowanie immunologiczne. Ogólnie rzecz biorąc, ten prosty i solidny protokół można zastosować do badania organizacji na poziomie tkankowym komórek rezydujących w tkance tłuszczowej, śledzenia linii komórek progenitorowych adipocytów i morfogenezy tkanki tłuszczowej podczas rozwoju.