Immunology and Infection
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प्रतिजनी रोग-विशिष्ट एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए Liposomes
Summary October 25th, 2018
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वर्णित प्रतिजनी liposomal नैनोकणों और इन विट्रो में और vivoमें उत्तेजक बी सेल सक्रियण में उनके उपयोग की तैयारी है । लगातार और मजबूत एंटीबॉडी प्रतिक्रियाएं एक नई मूंगफली एलर्जी मॉडल के विकास के लिए नेतृत्व किया । प्रतिजनी liposomes पैदा करने के लिए प्रोटोकॉल अलग प्रतिजनों और प्रतिरक्षण मॉडल के लिए बढ़ाया जा सकता है ।
Transcript
यह विधि इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है, जैसे कि सफेद रक्त कोशिकाएं कैसे सक्रिय होती हैं, और व्यक्तिगत एलर्जी से एलर्जी कैसे विकसित होती है? इस मजबूत और प्रजनन योग्य एलर्जी माउस मॉडल का मुख्य लाभ यह है कि कम चूहों का उपयोग प्रयोगात्मक आबादी के साथ कम विचरण करने के लिए किया जा सकता है। प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करने के लिए नई इम्यूनोथेरपी वीवो प्रभावकारिता में परीक्षण के प्रारंभिक साधन के रूप में मजबूत माउस मॉडल की आवश्यकता होती है।
इस प्रकार, इस तकनीक के निहितार्थ एलर्जी इम्यूनोथेरेपी की ओर विस्तार करते हैं। हालांकि यह विधि एलर्जी में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, इसे अन्य प्रणालियों पर भी लागू किया जा सकता है, जैसे कि ऑटोनियुमुइंस जिसमें अवांछित एंटीबॉडी प्रतिक्रियाएं बीमारी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। आम तौर पर, इस विधि के लिए नए व्यक्ति लिपोसोमल नैनोकणों के साथ काम करने में अनुभव की कमी या माउस के काम में आवश्यक तकनीकों के साथ अनुभवहीनता के कारण संघर्ष करेंगे।
प्रोटीन के लिए विषमताकार क्रॉसलिंकर के 2.5 मोलर समकक्ष जोड़कर शुरू करें और लगभग एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक दोलन शेखर पर प्रतिक्रिया रखें। एसपीडीपी के साथ एक घंटे की इनक्यूबेशन के बाद, 100-मिलीमोलर सोडियम एसीटेट में एक कॉलम पर प्रोटीन को कम करें, और अंशों को इकट्ठा करें। 280-नैनोमीटर अवशोषण निर्धारित करें, और शीर्ष अंशों को पूल करें।
पीबीएस में कॉलम धोएं, और पांच से 10 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए पूल किए गए प्रोटीन अंशों में 25-मिलीमोलर डिइयोथरेटोल या डीटीटी जोड़ें। फिर, प्रोटीन और लिंकर की मोलेरिटी के आधार पर लिंकिंग अनुपात की गणना की अनुमति देने के लिए प्रोटीन के 280 और 343-नैनोमीटर अवशोषण को मापें। इसके बाद, पीबीएस-धुले हुए कॉलम के पूल किए गए अंशों को चलाएं, और प्रदर्शन के अनुसार 280-नैनोमीटर और शीर्ष अंश पूलिंग के माप के लिए अंश एकत्र करें।
कोमल घूमता के साथ एक 1x, 10 गुना मोलर अतिरिक्त अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रोटीन के लिए 100x DSPE-PEG2000-Maleimide की उचित मात्रा जोड़ें । फिर, एक सील गोल-नीचे फ्लास्क में नाइट्रोजन के तहत प्रतिक्रिया रात भर चलाएं। अगले दिन, एक क्रॉसलिंक्ड डेक्सट्रान जेल मनका कॉलम पर प्रोटीन चलाएं, और लिपिड से जुड़े प्रोटीन के अंतिम पूल्ड अंशों को उनके उपयोग तक चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
एक बार प्रत्येक लिपिड की सही मात्रा की गणना की गई है, एक 12 मिलीलीटर बोरोसिलिकेट ग्लास टेस्ट ट्यूब में लिपिड के सभी गठबंधन, और एक तीन मिलीलीटर सिरिंज और ट्यूबिंग का उपयोग करने के लिए ध्यान से नाइट्रोजन के साथ बंद क्लोरोफॉर्म उड़ा । फिर, रातोंरात डीएमएसओ के 100 माइक्रोलीटर के साथ समाधान को ल्योफाइलाइज करें। अगली सुबह, लिपिड से जुड़े प्रोटीन का एक मिलीलीटर 12 मिलीलीटर लिपिड ट्यूब में जोड़ें, और सोनिकेशन पानी स्नान में 30 से 60 सेकंड के लिए तीन से चार बार समाधान को सोनिकेट करें, जिसमें कम से कम पांच मिनट की टिकी हुई है।
अंतिम सोनीशन के बाद, नमूने को एक्सट्रूडर में रखे एक्सट्रूडिंग सिरिंज में से एक में लोड करें, और एक्सट्रूडर सिरिंज को एक्सट्रूडर के दूसरे छोर में रखें। खाली सिरिंज पॉलीकार्बोनेट 0.8 माइक्रोमीटर झिल्ली के माध्यम से लिपिड को बाहर निकालने के रूप में भर जाएगी। पूरी तरह से इकट्ठे हुए एक्सट्रूडर को हीटिंग ब्लॉक में रखें, और सिरिंज को खाली करने के लिए धीरे-धीरे प्लंजर को दबाना।
अंतिम निष्कासन के बाद, लिपोसोम्स को एक साफ शीशी में स्थानांतरित करें, और लिपिड को पॉलीकार्बोनेट 0.2 और 0.1 माइक्रोमीटर झिल्ली के माध्यम से बाहर निकालें जैसा कि सिर्फ प्रदर्शन किया गया है। इसके बाद लिपोसोम्स को चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। एंटीजेनिक लिपोसोम एक्टिवेशन के लिए बी-सेल प्रतिक्रिया की निगरानी करने के लिए, कैल्शियम फ्लक्स लोडिंग बफर में सातवें स्प्लेनोसाइट्स को 1.5 गुना 10 से अधिक रीसस्लपेंड करें, और कोशिकाओं में 1.5 माइक्रोमोलर इंडो-1 जोड़ें, मिश्रण करने के लिए कई बार ट्यूब में समाधान को उलटा करें।
30 मिनट के पानी के स्नान के बाद ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन, प्रकाश से संरक्षित, कैल्शियम प्रवाह लोड बफर की मात्रा पांच गुना जोड़ें, और भारत-1 लेबल कोशिकाओं अपकेंद्रित्र । बी-सेल गेटिंग के लिए, एंटी-सीडी 5 और एंटी-बी220 एंटीबॉडी के साथ दाग कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर लोडिंग बफर के ०.५ मिलीलीटर में, प्रकाश से संरक्षित । इनक्यूबेशन के अंत में, ताजा कैल्शियम फ्लक्स लोडिंग बफर में कोशिकाओं को धोएं, और बर्फ पर भंडारण के लिए बफर चलाने वाले ताजा कैल्शियम फ्लक्स के सातवें कोशिकाओं को एक से दो गुना 10 पर गोली को फिर से खर्च करें, विश्लेषण तक प्रकाश से सुरक्षित रहें।
इसके बाद, एक छाया, पांच मिलीलीटर, गोल-नीचे, पॉलीस्टीरिन ट्यूब में कोशिकाओं के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें, और कोशिकाओं को पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। तीन से पांच मिनट के बाद, ट्यूब को एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी-जैकेट कक्ष में स्थानांतरित करें जो एक पुनः प्राप्त पानी स्नान से जुड़ा हुआ है, और प्रवाह साइटोमीटर पर पानी-जैकेट में ट्यूब चलाएं। प्रति सेकंड 5, 000 से 10, 000 घटनाओं को इकट्ठा करने के बाद, कोशिकाओं को 15 से 30 सेकंड के लिए स्थिर करने की अनुमति दें, और डेटा अधिग्रहण को फिर से तैयार करें, पृष्ठभूमि पढ़ने की स्थापना के लिए कम से कम 10 सेकंड के लिए डेटा एकत्र करें।
10 सेकंड के निशान पर, प्रवाह साइटोमीटर से ट्यूब को जल्दी से हटा दें, और एंटीजेनिक लिपोसोम की उचित प्रयोगात्मक एकाग्रता जोड़ें। फिर, पल्स भंवर कोशिकाओं, और एक अतिरिक्त तीन से पांच मिनट के लिए साइटोमीटर पर ट्यूब पढ़ें। जानवरों को जागरूक करने के लिए, प्रत्येक चार से पांच सप्ताह पुराने BALB/c महिला माउस प्राप्तकर्ता के लिए मौखिक gavage के माध्यम से हैजा विष युक्त मूंगफली निकालने के २०० microliters उद्धार तीन सप्ताह के लिए एक सप्ताह में एक बार और चौथे सप्ताह में पतला मूंगफली निकालने के ३०० माइक्रोलीटर ।
28 दिन, पीबीएस में मिलीलीटर प्रति मिलीग्राम एक मिलीग्राम की अंतिम एकाग्रता के लिए मूंगफली निकालने तैयार करें, और प्रत्येक संवेदनशील जानवर के बेसलाइन शरीर के तापमान को मापने के लिए एक गुदा थर्मामीटर का उपयोग करें। जब तापमान के सभी मापा गया है, इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से प्रत्येक प्राप्तकर्ता को मूंगफली निकालने के २०० माइक्रोलीटर प्रशासन, और इंजेक्शन के बाद एक घंटे के लिए हर 15 मिनट गुदा थर्मामीटर के साथ शरीर के तापमान को मापने । शरीर के तापमान में गिरावट मूंगफली से एलर्जी का संकेत देती है।
मूंगफली-एलर्जी चूहों से स्प्लेनोसाइट्स को अलग करने के बाद, 27 गेज से लैस एक मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करें, 5/8 इंच की सुई को नसों में 1.5 गुना 10 इंजेक्ट करने के लिए निकाले गए एलर्जी के सातवें हिस्सा भोले, असंवेदित जानवरों की पूंछ नसों में। दत्तक स्थानांतरण के एक दिन बाद, नसों में आरा एच 2 एंटीजेनिक लिपोसोम के २०० माइक्रोलीटर को प्रत्येक बाल्ब/सी माउस की पूंछ नस में इंजेक्ट करें जो एलर्जी स्प्लेनोसाइट्स प्राप्त करते हैं । लिपोसोम इंजेक्शन के दो सप्ताह बाद, चूहों को एक आईपी के साथ बढ़ावा दें।
घुलनशील आरा एच 2 का इंजेक्शन, इसके बाद ६१ दिन में २००-माइक्रोलीटर आरा एच 2 चैलेंज । फिर, प्रदर्शन के रूप में हर 15 मिनट में गुदा जांच के साथ शरीर के तापमान को मापने। प्रोटीन संयुग्मण एक कम जेल चलाकर प्रदर्शित किया जा सकता है जो अनियोजित प्रोटीन की तुलना में आणविक वजन में वृद्धि दिखाता है।
एंटीजेनिक लिपोसोम-उत्तेजित बी-सेल कैल्शियम फ्लक्स का आकलन करने के लिए, बी 220-पॉजिटिव सीडी 5-निगेटिव बी कोशिकाओं के चयन की अनुमति देने के लिए लाइव सिंगल कोशिकाओं को गेट करें। समय के साथ इंडो-1 वायलेट बनाम इंडो-1 ब्लू फ्लोरेसेंस के अनुपात का विश्लेषण किया जा सकता है ताकि लिपोसोम-प्रेरित बी-सेल एक्टिवेशन की मात्रा का आकलन किया जा सके । एलिसा द्वारा मूंगफली निकालने-संवेदनशील चूहों के सीरम में आरा एच 2-विशिष्ट आईजीई और IgG1 का परिमाणीकरण इंगित करता है कि प्रदत्त संवेदनशीलता वाले चूहों को उनके सीरम में आरा एच 2 प्रदर्शन मापने योग्य आरा एच 2-विशिष्ट आईजीई और IgG1 के साथ बढ़ाया जाता है।
शरीर के तापमान आरा एच 2 चुनौती के दौरान दर्ज की गई पता चलता है कि एलर्जी चूहों चुनौती के बाद शरीर के तापमान में कमी का प्रदर्शन, जबकि भोले चूहों में शरीर के तापमान लगातार रहते हैं । इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, लिपिड से जुड़े प्रोटीन की मात्रा को लिपोसोम्स में शामिल किए जाने का ध्यान से ट्रैक रखना याद रखना महत्वपूर्ण है, क्योंकि बहुत अधिक प्रोटीन एक्सट्रूशन को मुश्किल बना सकता है। इस प्रक्रिया के बाद, एलर्जी-विशिष्ट बी और टी कोशिकाओं की ट्रैकिंग और छंटाई जैसे अन्य तरीकों को अतिरिक्त सवालों के जवाब देने के लिए किया जा सकता है कि ये एलर्जी-विशिष्ट कोशिकाएं उपचारों का जवाब कैसे देती हैं।
इस तकनीक से एलर्जी के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए इस माउस मॉडल का उपयोग करके एलर्जी रोग का मुकाबला करने वाली नई इम्यूनोथेरपी का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त होगा । यह न भूलें कि हैजा टॉक्सिन के साथ काम करना खतरनाक हो सकता है और इसके उपयोग के लिए दिशानिर्देशों का पालन आपके स्थानीय संस्थागत जैविक सुरक्षा मानकों के अनुसार किया जाना चाहिए।
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