Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Antigen liposomer for generering av sykdom-spesifikke antistoffer
Summary October 25th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Beskrevet er utarbeidelsen av antigen liposomal nanopartikler og deres bruk i stimulerende B-celle aktivering i vitro og vivo. Konsekvent og robust antistoff svar førte til utviklingen av en ny peanøttallergi modell. Protokollen for å generere antigen liposomer kan utvides til forskjellige antigener og immunisering modeller.
Transcript
Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen immunologi, for eksempel hvordan aktiveres hvite blodlegemer, og hvordan utvikler allergier mot individuelle allergener? Den største fordelen med denne robuste og reproduserbare allergimusmodellen er at færre mus kan brukes til å gi en lavere varians med en eksperimentell befolkning. Nye immunterapier for å kontrollere immunresponser krever robuste musemodeller som et første middel for testing in vivo-effekt.
Dermed strekker implikasjonene av denne teknikken seg mot allergiimmunterapi. Selv om denne metoden kan gi innsikt i allergier, kan den også brukes på andre systemer, for eksempel autoimmunitet der uønskede antistoffresponser spiller en nøkkelrolle i sykdommen. Vanligvis vil personer som er nye på denne metoden slite på grunn av mangel på erfaring i å jobbe med liposomale nanopartikler eller en uerfarenhet med teknikkene som kreves i musearbeidet.
Begynn med å legge til 2,5 molar ekvivalent av heterobifunctional crosslinker til proteinet og plassere reaksjonen på en oscillerende shaker ved romtemperatur i omtrent en time. Etter en times inkubasjon med SPDP, desalt proteinet på en kolonne likevektet i 100-millimolar natriumacetat, og samle fraksjonene. Bestem 280 nanometer absorbansen, og pool de øverste brøkene.
Vask kolonnen i PBS, og tilsett 25-millimolar dithiothreitol, eller DTT, til de samlede proteinfraksjonene for en fem til 10-minutters inkubasjon. Deretter måler du 280 og 343 nanometer absorbans av proteinet for å tillate beregning av koblingsforholdet basert på molariteten av protein og linker. Deretter kjører du de samlede brøkene av den PBS-vasket kolonnen, og samler brøkene for måling av 280 nanometeret og toppfraksjonspooling som demonstrert.
Tilsett riktig volum på 100x DSPE-PEG2000-Maleimide til proteinet for å oppnå en 1x, 10-fold molar overflødig endelig konsentrasjon med mild virvlende. Deretter kjører du reaksjonen over natten under nitrogen i en forseglet rund bunnkolbe. Neste dag, kjøre proteinet over en krysskoblet dextran gel perle kolonne, og lagre de endelige samlede fraksjoner av lipid-koblet protein på fire grader Celsius til bruk.
Når riktig mengde av hver lipid er beregnet, kombinere alle lipidene i en 12-milliliter borosilikat glass testrør, og bruke en tre-milliliter sprøyte og rør for å forsiktig blåse kloroformen av med nitrogen. Deretter lyofilisere løsningen med 100 mikroliter DMSO over natten. Neste morgen, legg til en milliliter lipid-koblet protein til 12-milliliter lipid rør, og sonicate løsningen tre til fire ganger i 30 til 60 sekunder per sonikering i en sonikering vannbad med minst fem minutters hviler mellom sonikering.
Etter den siste sonikeringen, last prøven inn i en av de ekstruderende sprøytene som er plassert i ekstruderen, og legg ekstrudersprøyten i den andre enden av ekstruderen. Den tomme sprøyten vil fylles når lipiden ekstruderes gjennom polykarbonat 0,8-mikrometermembranen. Plasser det ferdig monterte ekstruderet i en varmeblokk, og trykk stempelet forsiktig ned for å tømme sprøyten.
Etter siste ekstrudering, overfør liposomer til et rent hetteglass, og ekstrudere lipidene gjennom polykarbonat 0,2 og 0,1-mikrometer membraner som nettopp demonstrert. Deretter lagrer du liposomer på fire grader Celsius. For å overvåke B-cellerespons på antigen liposomaktivering, gjenoppstår du 1,5 ganger 10 til de syvende miltytene i kalsiumflukslastebufferen, og legger til 1,5 mikromolar Indo-1 til cellene, inverterer oppløsningen i røret flere ganger for å blande.
Etter en 30-minutters vannbad inkubasjon på 37 grader Celsius, beskyttet mot lys, tilsett fem ganger volumet av kalsium fluks lasting buffer, og sentrifuge Indo-1-merkede celler. For B-celle gating, flekkceller med anti-CD5 og anti-B220 antistoff i 0,5 milliliter lasting buffer ved fire grader Celsius i 20 minutter, beskyttet mot lys. På slutten av inkubasjonen, vask cellene i fersk kalsiumflukslastbuffer, og gjenoppuspend pelleten på en til to ganger 10 til de syvende cellene per milliliter fersk kalsiumfluks løpebuffer for lagring på is, beskyttet mot lys til analyse.
Deretter legger du til 0,5 milliliter celler til en avkortet, fem milliliter, rund bunn, polystyrenrør og varme cellene til 37 grader Celsius i et vannbad. Etter tre til fem minutter, overfør røret til et 37-graders Celsius vannjakket kammer koblet til et resirkulerende vannbad, og kjør røret i vannjakken på strømningssytometeret. Etter å ha samlet 5000 til 10 000 hendelser per sekund, la cellene stabilisere seg i 15 til 30 sekunder, og gjenopprette datainnsamlingen, samle inn dataene i minst 10 sekunder for å etablere en bakgrunnslesing.
Ved 10-sekundersmerket fjerner du raskt røret fra strømningssytometeret, og legger til riktig eksperimentell konsentrasjon av antigene liposomer. Deretter, puls virvel cellene, og lese røret på cytometeret i ytterligere tre til fem minutter. For å sensibilisere dyrene, lever 200 mikroliter peanøttekstrakt som inneholder koleratoksin via oral gavage til hver fire til fem uker gamle BALB / c kvinnelige musmottaker en gang i uken i tre uker og 300 mikroliter fortynnet peanøttekstrakt i fjerde uke.
På dag 28, forberede peanøtt ekstrakt til en endelig konsentrasjon på ett mg per milliliter i PBS, og bruke et rektal termometer for å måle baseline kroppstemperaturen for hvert sensibiliserte dyr. Når alle temperaturene er målt, administrer 200 mikroliter peanøttekstrakt til hver mottaker via intraperitoneal injeksjon, og mål kroppstemperaturen med rektal termometeret hvert 15. En dukkert i kroppstemperaturen indikerer allergi mot peanøtt.
Etter å ha isolert miltytter fra peanøttallergiske mus, bruk en en milliliter insulinsprøyte utstyrt med en 27-gauge, 5/8-tommers nål for intravenøst å injisere 1,5 ganger 10 til den syvende av de ekstraherte allergiske miltytter i haleårene til naive, usensibiliserte dyr. En dag etter adoptivoverføring injiserer intravenøst 200 mikroliter ara h 2 antigene liposomer i halevenen til hver BALB/c-mus som mottok allergiske miltytter. To uker etter liposomet injeksjon, øke musene med en i.p.
injeksjon av løselig Ara h 2, etterfulgt av en 200-mikroliter Ara h 2 utfordring på dag 61. Deretter måler du kroppstemperaturen med rektalproben hvert 15. Proteinkonjugering kan demonstreres ved å kjøre en reduserende gel som viser en økning i molekylvekt sammenlignet med det ukonjugerte proteinet.
For å vurdere antigen liposomen-stimulert B-celle kalsium flux, gate live enkeltceller for å tillate valg av B220-positive CD5-negative B-celler. Forholdet mellom Indo-1 fiolett versus Indo-1 blå fluorescens over tid kan deretter analyseres for å vurdere mengden liposomet-indusert B-celleaktivering. Kvantifiseringen av Ara h 2-spesifikke IgE og IgG1 i serum av peanøttekstrakt-sensibiliserte mus av ELISA indikerer at mus med overdratt følsomhet som forsterkes med Ara h 2 viser målbar Ara h 2-spesifikk IgE og IgG1 i serumet.
Kroppstemperaturer registrert under Ara h 2-utfordringen viser at allergiske mus viser reduserte kroppstemperaturer etter utfordringen, mens kroppstemperaturen hos naive mus forblir konsistente. Mens du prøver denne prosedyren, Det er viktig å huske å nøye holde styr på mengden lipid-koblet protein blir innlemmet i liposomer, som for mye protein kan gjøre ekstrudering vanskelig. Etter denne prosedyren kan andre metoder som sporing og sortering av allergenspesifikke B- og T-celler utføres for å svare på flere spørsmål om hvordan disse allergenspesifikke cellene reagerer på terapier.
Denne teknikken vil bane vei for forskere i allergifeltet for å utforske nye immunterapier som bekjemper allergisk sykdom ved hjelp av denne musemodellen. Ikke glem at arbeid med koleratoksin kan være farlig, og at retningslinjene for bruk bør følges i henhold til dine lokale institusjonelle biologiske sikkerhetsstandarder.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE