Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Антигенные липосом для поколения болезни специфические антитела
Summary October 25th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Описал является подготовка антигенной липосомальных наночастиц и их использования в стимулировании B-клетки активации в пробирке и в естественных условиях. Последовательный и надежный антител привело к разработке новой модели арахиса аллергии. Протокол для генерации антигенной липосомы может распространяться на различные антигены и иммунизации модели.
Transcript
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, такие как, как белые кровяные тельца активированы, и как аллергия на отдельные аллергены развиваться? Основным преимуществом этой надежной и воспроизводимой модели мыши аллергии является то, что меньше мышей могут быть использованы для того, чтобы дать более низкую дисперсию с экспериментальной популяцией. Новые иммунотерапии для контроля иммунных реакций требуют надежных моделей мыши в качестве первоначального средства тестирования эффективности in vivo.
Таким образом, последствия этого метода распространяются на иммунотерапию аллергии. Хотя этот метод может обеспечить понимание аллергии, он также может быть применен к другим системам, таким как аутоиммунные заболевания, в которых нежелательные реакции антител играют ключевую роль в болезни. Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться из-за отсутствия опыта работы с липосомных наночастиц или неопытность с методами, необходимыми в работе мыши.
Начните с добавления 2,5 молярного эквивалента гетеробифункционального кросслинкера к белку и размещения реакции на колеблющийся шейкер при комнатной температуре в течение примерно одного часа. После часовой инкубации с ПОМОЩЬю SPDP, desalt белка на колонке equilibrated в 100-миллимолярный ацетат натрия, и собирать фракции. Определите абсорбанс 280 нанометров и объединить верхние фракции.
Вымойте столбец в PBS, и добавить 25-миллимолярный дитиотрейтол, или DTT, в объединились фракции белка в течение пяти до 10 минут инкубации. Затем измерьте 280 и 343-нанометровые абсорбансы белка, чтобы обеспечить расчет коэффициента связи на основе молярности белка и связующих звена. Затем запустите слились фракции промытой PBS колонны и соберите фракции для измерения 280-нанометрового и верхнего фракций, как это было продемонстрировано.
Добавьте соответствующий объем 100x DSPE-PEG2000-Maleimide к белку для достижения 1x, 10-кратной превышения конечной концентрации моляра с нежным закрученным. Затем запустите реакцию на ночь под азотом в запечатанной колбе с круглым дном. На следующий день запустите белок над перекрестным столбом шарика геля декстрана, и храните окончательные соединенные фракции липид-связанного протеина на 4 градусах Celsius до их пользы.
После того, как правильное количество каждого липида была рассчитана, объединить все липиды в 12-миллилитровый борозиликат стеклянной пробирке, и использовать три миллилитров шприца и трубки, чтобы тщательно взорвать хлороформ с азотом. Затем, лиофилизировать раствор с 100 микролитров DMSO в одночасье. На следующее утро добавьте один миллилитр липидного белка в 12-миллилитровую липидную трубку и проясните раствор три-четыре раза в течение 30-60 секунд на звуковой водяной бане с не менее чем пятиминутным отдыхом между звуковыми данными.
После последней звуковой нагрузки загрузите образец в один из экструдивных шприцев, помещенных в экструдер, и поместите экструдерный шприц на другой конец экструдера. Пустой шприц будет заполняться, как липид экструдирован через поликарбонат 0,8-микрометровой мембраны. Поместите полностью собранный экструдер в нагревательный блок и аккуратно угнетайте поршень, чтобы опорожнить шприц.
После последнего экструзии перенесите липосомы в чистый флакон и выдавите липиды через поликарбонатные 0,2 и 0,1-микрометровые мембраны, как это было продемонстрировано. Затем храните липосомы при четырех градусах по Цельсию. Чтобы контролировать реакцию B-клеток на антигенную липосомную активацию, повторно потекуте 1,5 раза 10 к седьмым спеноцитам в буфере загрузки потока кальция, и добавьте 1,5-микромолярную Индо-1 к клеткам, несколько раз инвертатив раствор в трубке для смешивания.
После 30-минутной инкубации водяной ванны при 37 градусах Цельсия, защищенных от света, добавьте в пять раз больше буфера нагрузки потока кальция и центрифугайте индо-1-маркированные клетки. Для B-клеточного гэтинга, пятна клеток с анти-CD5 и анти-B220 антитела в 0,5 миллилитров погрузочного буфера при четырех градусах по Цельсию в течение 20 минут, защищены от света. В конце инкубации, мыть клетки в свежем буфере потока кальция загрузки, и повторно гранулы в один-два раза от 10 до седьмой клетки на миллилитр свежего потока кальция работает буфер для хранения на льду, защищены от света до анализа.
Затем добавьте 0,5 миллилитров клеток в ограниченную пятими миллилитровую, круглую нижнюю, полистироловую трубку и согрейте клетки до 37 градусов по Цельсию на водяной бане. Через три-пять минут перенесите трубку в 37-градусную камеру с водяными куртками по Цельсию, подключенную к рециркацивной водяной бане, и запустите трубку в водяной куртке на цитометре потока. Собрав от 5 000 до 10 000 событий в секунду, позвольте ячейкам стабилизироваться в течение 15-30 секунд и восстановить сбор данных, собирая данные в течение по крайней мере 10 секунд, чтобы установить фоновое чтение.
На 10-секундной отметке быстро удалите трубку из цитометра потока и добавьте соответствующую экспериментальную концентрацию антигенных липосом. Затем пульс вихрем клетки, и читать трубку на цитометре в течение дополнительных трех-пяти минут. Чтобы сенсибилизировать животных, доставить 200 микролитров экстракта арахиса, содержащего токсин холеры через устные gavage к каждому четыре-пять недель BALB / C женский получатель мыши один раз в неделю в течение трех недель и 300 микролитров разбавленного экстракта арахиса в четвертую неделю.
На 28 день, подготовить экстракт арахиса до окончательной концентрации одного миллиграмма на миллилитр в PBS, и использовать ректальный термометр для измерения базовой температуры тела каждого сенсибилизированного животного. Когда все температуры были измерены, управлять 200 микролитров экстракта арахиса для каждого получателя через внутриперитонеальной инъекции, и измерить температуру тела с ректальным термометром каждые 15 минут в течение одного часа после инъекции. Падение температуры тела указывает на аллергию на арахис.
После изоляции спленоцитов от мышей с аллергией на арахис используйте одноми миллилитровый инсулиновый шприц, оснащенный 27-дюймовой 5/8-дюймовой иглой, чтобы внутривенно вводить 1,5 раза в седьмую часть извлеченных аллергических спеноцитов в хвостовые вены наивных, несенсибилизированных животных. На следующий день после принятия передачи внутривенно вводят 200 микролитров антигенных липосом Ara h 2 в хвостовую вену каждой мыши BALB/c, которая получала аллергические спеноциты. Через две недели после инъекции липосомы, увеличить мышей с i.p.
инъекция растворимых Ара h 2, а затем 200-микролитер Ара h 2 вызов на день 61. Затем, измерить температуру тела с ректальным зондом каждые 15 минут, как попродемонстрировано. Спряжение протеина можно продемонстрировать путем бежать уменьшая гель показывая увеличение в молекулярном весе сравненном к unconjugated протеину.
Для оценки антигенных липосом-стимулировали B-клеточный поток кальция, ворота живых одиночных клеток, чтобы выбор B220-положительных CD5-отрицательных В-клеток. Соотношение индо-1 фиолетовый по сравнению с Индо-1 синий флуоресценции с течением времени могут быть проанализированы для оценки количества липосомы индуцированной B-клеточной активации. Количественная оценка Ara h 2-специфических IgE и IgG1 в сыворотке арахиса экстракт-сенсибилизированных мышей ELISA указывает на то, что мыши с присвоенной чувствительности, которые повышаются с Ара ч 2 экспонат измеримых Ара h 2-специфических IgE и IgG1 в их сыворотке.
Температура тела, зарегистрированная во время Ara h 2 вызов показывают, что аллергические мыши демонстрируют снижение температуры тела после вызова, в то время как температура тела у наивных мышей остаются последовательными. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы тщательно отслеживать количество липидных белков, связанных с включены в липосомы, так как слишком много белка может сделать экструзии трудно. После этой процедуры, другие методы, такие как отслеживание и сортировка аллерген-специфических В и Т-клеток могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы о том, как эти аллерген-специфические клетки реагируют на терапии.
Этот метод проложит путь для исследователей в области аллергии, чтобы исследовать новые иммунотерапии, которые борются с аллергическими заболеваниями с помощью этой модели мыши. Не забывайте, что работа с токсином холеры может быть опасной и что руководящие принципы для его использования должны соблюдаться в соответствии с местными институциональными стандартами биологической безопасности.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE