Medicine
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温度控制384孔板中用 Ca 敏感荧光染料测定人 iPSC 的心肌细胞较多的收缩
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Summary October 18th, 2018
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人诱导的多潜能干细胞自发收缩心肌细胞较多是人类心脏生理学和药理学的有用模型。在这里, 我们提出了一个高通量的筛选系统, 以量化的影响, 外源化合物对跳动频率, 使用 Ca 敏感荧光染料和温度控制成像多孔板读取器。
Transcript
该方法有助于回答心脏安全药理学领域关键问题。例如，新的人类药物有改变正常心脏节律的风险吗？该技术的主要优点是，它可以快速评估大量的化合物，并以中等成本。
演示这个程序的将是卡米尔·唐尼，我实验室的一名副研究员。为了准备测量人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（HIPSCCMs）的同步收缩，首先将含有冷冻细胞的冷冻管放在37摄氏度的水浴中两分钟。将整个解冻的细胞悬浮液从每个管转移到一个单一的、新鲜的 50 毫升锥形管。
要取回剩余的细胞，请用一毫升37摄氏度的预预热电镀介质清洗每个管，并将这种介质添加到含有解冻细胞的50毫升锥形管中。在管子中加入八毫升热电镀介质，小心地混合悬浮液。使用 trypan 蓝色排除方法和血细胞计来计算活细胞。
通过添加暖电介质，将浓度调整为每毫升5万个细胞。要将细胞分布到两个新的384孔细胞培养板中，每孔加入25微升，每井将产生约12，500个细胞。在加湿的大气中384孔板块中，用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育细胞，共3至4周。
第二天，用50微升的暖质维护介质更换电镀介质。之后，每两到三天更换一半的维护介质。第7天、第14天和21天，完全更换介质。
一旦细胞在培养中维持三到四周，它们就自发地收缩，并且可以测量化合物对这些收缩的影响。在测定当天，在第一个单元板被放入板读取器内进行测量之前至少两个小时，打开读卡器，将加热系统设置为 37 摄氏度。要准备复合板，温暖至室温40毫升的维护介质，辅以1%体积的青霉素链霉素。
当介质预热时，通过每孔添加 1.5 微升的库存溶液，将测试化合物和控制装置分配到两个 384 孔复合板中。将复合板在 100 G 下离心一分钟。在每个孔中加入37微升的维护介质，并在100G下再次离心板1分钟。
为了准备荧光染料，在37摄氏度的水浴中加热100毫升的维持介质，辅以1%的体积青霉素链霉素。然后，将10毫升的加热介质加入钙敏感荧光染料和淬火剂的混合物中，将其重新构成库存荧光介质。启动板读卡器软件。
准备软件以记录两分钟钙波段，采集频率至少为 10 赫兹。为了使每个细胞板的荧光介质，用抗生素稀释3毫升的库存荧光介质，用12毫升的暖维持介质。用30微升荧光介质在细胞板的每个井中更换20微升的介质，然后上下移液一次。
紧接着，将板放入板读卡器中，让 HIPSCCM 调整至读卡器温度 60 分钟。然后，启动板读卡器软件。记录两分钟段的钙波，采集频率至少为 10 赫兹，以定义每井的基线跳动速率。
在数据采集后，确保电池板不会从设备中传输出来非常重要。对于某些软件版本，您必须在录制完全结束之前停止录制。使用板读卡器机器人移液五微升的测试和参考化合物井到井从复合板到细胞板。
之后，在板读卡器软件中开始数据采集，从复合物添加后 5 分钟、15 分钟、30 分钟、45 分钟和 60 分钟开始记录两分钟的钙波段。要开始数据分析，请从 ASCII 文本文件中的板读卡器软件导出每个记录周期的原始数据。然后将它们导入数据分析软件。
从数据分析软件中，将每个录制周期的主要跳动频率导出为剪贴板副本。提取每个井和每个时间点的主要跳动频率。最后，通过剪贴板粘贴将跳动频率导入电子表格软件，然后继续文本协议中描述的数据分析。
在一个384孔板的基线记录钙波表明，在大多数情况下，所有孔都显示有规律的跳动率，整个板块的变异性很小。当添加心脏离子通道的阻滞剂时，它们会影响心肌细胞的节奏。Amlodipine，慢钙通道的阻滞剂，以一个微摩尔的浓度依赖方式加速节奏超过100%。
最重要的是，阿梅洛迪平逮捕了殴打者。E-4031，快速延迟整流剂钾通道的阻滞器以高达10微摩尔的浓度依赖方式减速约65%至70%的节奏。特特罗多毒素，一种快速钠通道的阻滞剂，以1至30微摩尔的浓度依赖方式将节奏减速约15%，而超过30微摩尔的四多毒素则会在第五分钟内停止殴打。
Bepridil是心脏钠、钙和钾通道的混合阻滞剂，也会产生全有或全无效应，表明钠通道阻滞是百丙草的主要作用。在尝试此过程时，在细胞培养板中移液时，必须记住要非常温和。这些组织非常脆弱，如果被移液器触摸，很容易损坏。
不要忘记，使用人体细胞和活性药物可能是危险的，在执行此过程时，应始终采取预防措施，如戴上安全手套和眼镜。
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