Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
TChIP-Seq: Профилирование конкретного типа ячейки Epigenome
Chapters
Summary January 23rd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Мы опишем пошаговое протокол для тандем хроматина иммунопреципитации последовательности (tChIP-Seq), который позволяет проводить анализ изменения определенного типа клеток геном wide гистонов.
Transcript
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эпигенетики, такие как, сколько хроматических модификаций регулируются определенным образом типа клетки вместе с геномами. Основным преимуществом этой техники является то, что мы можем изолировать хроматин от целевых клеток, а затем следовать типичным цыган вниз по течению. Таким образом, этот метод может обеспечить понимание нейрона конкретных триминцил, лисинк 4, opisoncilly.
Он также может быть применен к другим модификации гистон, другие типы клеток, а затем другие модели организмов. Демонстрацией процедуры будет Мари Мито, техник из моей лаборатории. Для начала используйте тонкие весенние ножницы, чтобы вскрыть ткани интерес на мелкие кусочки.
Добавьте фрагменты тканей в чистый контейнер, наполненный жидким азотом. Затем перенесите фрагменты тканей в две миллилитровые трубки, наполненные жидким азотом. Храните трубки при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение пяти минут с крышкой открытой для испарения жидкого азота.
Поместите трубки, содержащие образцы тканей, на охлажденную металлическую ледяную стойку. Затем поместите металлическую пулю в 1,5 миллилитровую трубку и охладите ее жидким азотом. Поместите охлажденную металлическую пулю в одну из пробных трубок.
Закройте крышку и установите трубку в трубку держателя криогенной шлифовальной машины. Немедленно окуните собранный держатель трубки в жидкий азот на одну минуту. Вставьте замороженный держатель трубки во внешнюю кассету криогенной шлифовальной машины.
И встряхните его энергично в течение 30 секунд, 60 раз. После этого разберите криогенную мясорубку, удалите металлическую пулю. И поместите трубку в предварительно охлажденный кулер образца.
Храните кулер при отрицательном 20 градусов по Цельсию в течение 15 минут. Затем добавьте 900 микролитров 1%формальдегида в трубку и пипетку для смешивания. Перенесите подвеску на новую двухми миллилитровую трубку с 900 микролитров 1%формальдегида.
Затем зафиксьте подвеску на 10 минут с нежным вращением при 23 градусах по Цельсию. Чтобы остановить реакцию фиксации, добавьте в трубку 100 микролитров 2,5 молярного глицина. И центрифуга при 3000 раз гравитации в течение пяти минут при четырех градусах цельсия.
После этого, отказаться от супер супернатанта. Добавить один миллилитр PBS в трубку и вихрь, чтобы смешать. Центрифуга при 3000 раз гравитации в течение пяти минут при четырех градусах цельсия.
Повторите этот шаг мытья, еще два раза. Затем добавьте 500 микролитров буфера лиза один к гранулам и пипетки для смешивания. Центрифуга трубки в течение пяти минут при 3000 раз тяжести при четырех градусах по Цельсию и отказаться от супернатанта.
Добавьте один миллилитр буфера лиза два гранулы и вихрь, чтобы смешать. Затем центрифуга подвески в течение пяти минут при 3000 раз тяжести при четырех градусах по Цельсию и отбросить супернатант. После этого добавьте 800 микролитров буфера анализа радиодефицита с ингибитором протеазы в гранулы и пипетку для смешивания.
Центрифуга подвески в течение пяти минут при 3000 раз тяжести при четырех градусах по Цельсию и отказаться от супернатанта. Затем добавьте в гранулы 500 микролитров буфера RIPA с ингибитором протеазы. Затем центрифуга подвески в течение пяти минут при 3000 раз тяжести при четырех градусах по Цельсию и отбросить супернатант.
Добавьте один миллилитр буфера RIPA с коктейлем ингибитора протеазы. Сразу же после добавления буфера RIPA с коктейлем ингибитор протеазы, перенесите лизат в трубку sonicator. И поместите трубку на ультразвуковой.
Используя настройки, изложенные в текстовом протоколе, свяйте хроматин. Затем перенесите образец в 1,5 миллилитровую белковую трубку с низким связывающим. И центрифугать его в течение пяти минут при 20 000 раз гравитации при четырех градусах Цельсия.
Соберите супернатант из образца и перенесите его в новую белковую трубку с низким связывающим. В этом протоколе было введено и продемонстрировано тандемное секвенирование иммунопреципиентации хроматина. Во время процедуры качество ДНК проверялось на нескольких этапах.
Сразу же после звуковой связи, стрижка ДНК была изолирована и протестирована с помощью микрофлюидной электрофорезной машины. После использования анти-FLAG антитела и анти-H3K3me3 антитела для выполнения сродства очистки качества ДНК была проверена снова. Специфика иммунной очистки ДНК на H2B-FLAG была подтверждена отрицательными контрольных пробами.
Где было обнаружено незначительное количество ДНК. Далее в протоколе было проверено качество библиотеки секвенирования. Успешные ChIP и T-ChIP были улики с помощью анализа обогащения с использованием грунтовки ориентации промоутер области гена GAPDH.
Получены репрезентативные перераспределения по трем генам нейронов. И обогащение читает на пяти основных концах генов нейроном T-ChIP искать на весь мозг T-ChIP искать наблюдалось. После стабилизации, этот метод прокладывает путь для исследователей в эпигенетической области для изучения типа клеток конкретных модификаций гистона в целом широко в нейронах у мышей.
Не забывайте, что работа с формальдегидом может быть чрезвычайно опасной и принимать меры предосторожности, такие как ношение резиновой одежды и очков, всегда следует принимать при выполнении этой процедуры.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
