Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Modellering tuberkulos i Mycobacterium marinum infekterade vuxna zebrafiskar
Chapters
Summary October 8th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Här presenterar vi ett protokoll till modell human tuberkulos i en vuxen zebrafiskar som använder dess naturliga patogen Mycobacterium marinum. Extraherad DNA och RNA från de inre organen av infekterade zebrafiskar kan användas för att avslöja totalen mykobakteriella laster i fisken och värdens immunsvar med qPCR.
Transcript
Denna metod kan bidra till att besvara viktiga frågor inom tuberkulosområdet såsom vad som är rollen av adaptiva immunsvar och patogenesen vid denna multifaktoriella sjukdom. Den största fördelen med denna nukleinsyrabasmetod är att både bakteriebelastningar och genuttrycksnivåer kan mätas från samma individ. Till att börja detta förfarande, kultur M.marinum på en 7H10 platta som beskrivs i textprotokollet.
Överför 10 milliliter 7H9 medium innehållande ADC-anrikning, polysorbat 80, och glycerol till en cellodlingskolv. Använd sedan en steril en mikroliter inokuler slinga för att aseptisk överföra en loopful av M.marinum bakteriemassa i kolven. Lämna locket löst eller använd ett filterlock för att möjliggöra tillräckligt gasutbyte och kultur vid 29 grader Celsius i mörker utan att skaka i tre till fyra dagar tills OD600 når ca 0,7.
Späd och fortsätt att kultföra bakterierna som beskrivs i texten. För att börja förbereda bakterielösningen för infektion, överför en milliliter av kulturen till ett färskt rör. Centrifugera vid 10, 000 g i tre minuter.
Ta bort supernatanten och resuspend pelleten i en milliliter av steril PBS. Använda steril PBS med en 0,3 milligram per milliliter av fenol röd som en spårämne, späd suspensionen för att nå önskad bakteriell koncentration. Efter detta, använd en en milliliter spruta för att långsamt dra suspensionen genom en 27 gauge nål tre gånger.
Utför detta steg precis före användning för varje alikvot. Först pipettera en fem mikroliterdropp av den utspädda bakterielösningen på en bit paraffinfilm. Dra sedan droppen i en 30 gauge insulin nål.
Använd en fem till åtta månader gammal fisk för detta experiment med en är en vild typ fisk och den andra är en trasa mutant fisk. Placera dessa fiskar ventrala sidan upp i slitsarna av en bit fuktig skummad plast. Injicera insulinnålen mellan bäckenfenorna i 45 graders vinkel.
Håll nålöppningen uppåt för att säkerställa att hela öppningen är inne i bukhålan. Injicera sedan långsamt den bakteriella lösningen. Efter detta, försiktigt bort nålen och omedelbart överföra fisken till en återhämtning tank fylld med färsk tankvatten.
Ta prover från bakterien alikvoten i bruk var 15:e minut på 7H10-plattor. Inkubera dessa prover vid 29 grader Celsius i fem dagar för att verifiera infektionsdosen. Kontrollera välbefinnande fisken regelbundet, se till att avliva någon fisk med infektionssymtom genom att inkubera dem i vatten med mer än 0,02%av 3-aminobenzoic syra etylester.
Efter euthanizing fisken, sätta in en stift posterior till branchiostegal strålar. Sätt in en andra stift genom svansen för att kryssa fisken på plattformen. Med hjälp av en skalpell, öppna hela bukhålan.
Använd sedan en liten sked och vassa pincett för att samla de inre organen som börjar i hjärtat och arbetar längs ryggraden mot svansen för att lossa alla inre organ i ett block. Använd pincett för att lossa tarmnätet från kloaken och för över organen till ett 1,5 milliliter homogeniseringsrör som innehåller ett halvt dussin 2,8 millimeters keramiska pärlor. Placera omedelbart röret på torris för att frysa provet.
Förvara provet vid negativa 80 grader Celsius tills det är klart att homogenisera. Efter att ha extraherat DNA och RNA, mät de mykobakteriella lasterna genom kvantitativ PCR som beskrivs i textprotokollet. I denna studie, vuxna zebrafisk är smittade med M.marinum genom en intraperitoneal injektion.
En hög infektionsdos ses leda till en progressiv sjukdom där den mykobakteriella belastningen fortsätter att öka tills den genomsnittliga belastningen når cirka fem miljoner bakterier som slutligen dödar fisken. En låg dos å andra sidan leder till utvecklingen av en sjukdom spektrum liknande den som ses i humantuberkulos med progressiv, latent, reaktiverad, och steriliserade infektioner. I detta fall fortsätter belastningen att öka i fyra veckor varefter sjukdomen når ett stabilt tillstånd i majoriteten av fisken.
Dessa data visar att det ursprungliga antalet mykobakterier som används för att infektera fisken är en kritisk determinant för utfallet av infektionen. Rag mutant zebrafish ses vara oförmögen att tillräckligt begränsa tillväxten av mykobakterier leder till högre bakteriebelastningar och ökad sjuklighet. Detta visar tydligt vikten av adaptiv immunitet för att kontrollera mycobacterial infektion.
Nivåerna av interleukin-4 är betydligt högre i gruppen vilda typ avslöjar att adaptiva svaret krävs för ett effektivt införande av interleukin-4, men dispensable för införande av interferon gamma efter mycobacterial infektion. Detta protokoll möjliggör insamling av både DNA och RNA från samma prov vilket gör det möjligt att kombinera provets mykobakteriella börda med genuttrycksdata av både värden och bakterierna. Denna teknik kan kombineras med administrering av läkemedel eller vaccinkandidater för att bedöma deras effekt på de mykobakteriella belastningarna och immunsvaren.
Samtidigt som man försöker detta förfarande, är det viktigt att komma ihåg att följa de lokala riktlinjerna för personlig säkerhet och avfallshantering när man arbetar med en biosäkerhet nivå två patogen. Denna teknik gör det möjligt att studera både aktiv och latent tuberkulos med vilande mykobakterier i zebrafisken som är en etisk icke-däggdjurs in vivo-modell.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
