Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Gennemføre flere Imaging tilstande med et fluorescens mikroskop
Chapters
Summary October 28th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her præsenterer vi en praktisk vejledning i opbygning af en integreret mikroskopi system, som fletter konventionelle epi-fluorescerende imaging, enkelt-molekyle påvisning funderet super-resolution imaging og multi-farve enkelt-molekyle afsløring, herunder enkelt-molekyle fluorescens resonans energioverførsel imaging, i én set-up på en omkostningseffektiv måde.
Transcript
Denne metode kan hjælpe med at besvare vigtige spørgsmål i det optiske mikroskopifelt, f.eks. Den største fordel ved denne teknik er, at vi kunne kombinere tre forskellige billeddannelsesmoduler i ét mikroskop, hvilket reducerer de samlede omkostninger betydeligt. Visuel demonstration af denne metode er kritisk, da det er vanskeligt at lære samling af excitationsvejen.
De kræver korrekt valg af dele og en følsom optisk justering. Til at begynde med skal du installere et dataopkøbskort via en PCI-grænseflade og bruge det til at forbinde laserne til computeren. Styr lasere'on og off adfærd ved transistor-transistor logik output og deres effekt justering af den analoge output af dette kort.
Derefter forberedes et vibrationsisoleret optisk bord med spejle og bjælkesplittere som vist her og beskrevet i den medfølgende tekstprotokol. Kombiner laserstrålerne i en optisk fiber i enkelt tilstand ved først at montere en fiberadapterplade i en z-akseoversættelsesmontering. Dernæst montere en akromatisk doublet linse i et bur plade.
Brug en forlængerstang til at tilslutte adapteren og objektivet til at danne et bur. Brug derefter en tomme tykke optiske stolper til at montere buret på det optiske bord. Juster 647-nanometerlaseren ved at justere komponenterne for at opnå maksimal lasereffekt gennem fiberen.
Når tilpasningen af den første laser er færdig, midlertidigt installere et par iris og justere resten af lasere én efter én. Kontroller justeringseffektiviteten for hver laser med en effektmåler. Sørg for at efterlade en iris foran adapterpladen for at reducere laserenes refleksioner.
Dernæst skal du designe og installere forstørrelsesglasset som beskrevet i den medfølgende tekstprotokol. For at skabe den bygningsfejl effekt er nødvendige for at udvinde z-koordinaterne for hvert enkelt molekyle, skal du placere en 3D-linse med en 10-meter brændvidde i kassetten og indsætte den i emissionsstrålens vej. For at minimere vibrationerne under sekventiel flerfarvet epifluorescensbilleddannelse skal du bruge emissionsfiltre placeret i et barrierefilterhjul, der er forbundet ved siden af mikroskopet.
For samtidig multicolor detektion under enkelt-molekyle FRET eksperimenter, placere et andet filter sæt i en emission splitter. For at sætte op til diffraktion-begrænset billeddannelse ved hjælp af epi-excitation, skal du først justere excitationlaserens tilfældige vinkel til epi-tilstand i belysningsarmen. Dernæst frigøre 3D-linsen, og indsæt bypass terningen i emissionssplitteren.
Derefter indsætte mag linse for udvidet belysning. Når du er konfigureret, skal du tage billeder af din prøve med flere kanaler, z-stack og/eller tid baseret på de ønskede resultater. Hvis du vil opsætte eneret til enkeltmolekyledetektering af overfladeinmobiliserede molekyler, skal du først flytte filterhjulet til en tom position.
Dette vil gøre det muligt for lasere at passere igennem. Derefter justere excitation lasers'tilfældig vinkel til græstørv vinkel, og frigøre både mag og 3D linser. Derefter skal du aktivere trekanalstilstanden i emissionssplitteren ved først at erstatte bypass-terningen med en kalibreringskube, der gør det muligt for alt lyset at passere gennem alle kanaler.
Tænd derefter kameraet under DIC og juster blænden på emissionssplitteren, indtil der vises tre, fuldt adskilte kanaler på skærmen. Drej de vertikalt vandrette justeringsknapper på emissionssplitteren, og juster de tre kanaler groft. Sluk derefter derefter kameraet, og udskift kalibreringskuben med den tredobbelte kube.
Placer en prøve på 100-nanometer multi-kanal perler. Ved excitation ved 488 nanometer udsender de 100-nanometer multikanalperler forskellige bølgelængder af lys, hvilket muliggør trekanalsjustering. Tænd derefter kameraet og 488-nanometerlaseren, zoom ind på en af de lyse perler, og juster til sidst de tre kanaler ved at dreje justeringsknapperne igen.
Med prøven nu på plads, ved hjælp af en svag laser, navigere til et område med en rimelig spottæthed og justere laser magt og eksponeringstid for at opnå acceptable signal-til-støj og photobleaching niveauer. Brug derefter billedbehandlingssoftwaren til at tage billeder i gang. For super-opløsning billedbehandling, begynde med at indsætte 3D-linse og fjerne mag linse.
Derefter bestemme den optimale excitation laser tilfældige vinkel at være græstørv vinkel. For at finde den rette objektive højde for SR-billeddannelse skal du bruge DIC-billedbehandling til at finde cellernes midterste plan. Identificer planet efter den højde, hvor cellerne bliver gennemsigtige.
Når det ønskede brændplan er bestemt, skal du begynde at billeddannelse i superopløsning. Mens billeddannelse, ændre 405-nanometer laser magt til at opretholde en rimelig tæthed af blinkende-on pletter. Begynd billeddannelse uden violet laserkraft.
Tæl antallet af blinkende steder i en bestemt periode, og forøg den violette lasereffekt, så antallet af blinkende pletter holdes over en brugerdefineret optællingstærskel i synsfeltet. Analysér dataene ved at registrere centroiderne for hvert punkt i billedrammerne, og uddrag z-værdierne for hvert punkt fra X- og Y-bredderne. Byg et rekonstrueret billede, og visualiser objekter i 3D.
Denne mikroskop opsætning giver mulighed for fleksibel og reproducerbar skift mellem forskellige billeddannelse metoder, herunder konventionelle epifluorescerende billeddannelse, enkelt-molekyle detektion-baserede super-opløsning imaging, og flerfarvet enkelt-molekyle afsløring. For at afsløre finere detaljer i den molekylære samling kombinerer superopløsningsmikroskopi tusindvis af billeder som denne. Disse billeder rekonstrueres derefter for at generere et endeligt billede i superopløsning.
Super-opløsning teknikker giver mulighed for høj rumlig opløsning, der giver detaljer, der ikke kan ses med andre teknikker. Dette er fremhævet i de to billeder, der vises her. Den super-opløsning billedet viser den samme bakterielle regulerende RNase som epifluorescens billede, men giver mulighed for enkelt molekyle afsløring.
SmFRET er en anden metode, der kan angstrom til nanometer opløsning. Her blev foldede RNA-molekyler mærket med et grønt donorfarvestof og et rødt acceptorfarvestof. Fluorescens intensitet baner kan udvindes fra individuelle enkelt molekyler, genererer FRET effektivitet som en funktion af tid.
Glem ikke, at arbejde med lasere kan være farligt, og forholdsregler såsom at bære øjenbeskyttelse eller sænke laser beføjelser bør altid tages, hvor der udfører denne procedure.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
