一种用于检测汞和镉的厌氧生物传感器检测方法

这种方法可以帮助回答有关镉和汞的生物地球化学循环关键问题，例如不同的环境变量如何影响它们对细菌的生物利用度。这项技术的主要优点是，它提供准实时生物利用数据和可行的细胞，而不管是否存在氧气。通常，对这种方法的新鲜人会很难以为向，因为有很多时间敏感的步骤需要非常细致地注意细节。

演示这个程序的将是本，一个研究生从我的实验室。为准备检测，从零下80摄氏度的低温物中取回汞可感知生物传感器和组织表达的生物传感器。将细胞板化为Lysogeny肉汤盘，每毫升安西林含有120微克。

在37摄氏度的孵化器中种植板培养物。下午4:30至5.m用安西林在10毫升LB中接种培养，并在37摄氏度下在37摄氏度下过夜生长，在220转/小时摇晃。

第二天上午.m，将培养和先前准备好的生长培养基带进厌氧室。然后将8毫升新鲜生长介质和每毫升安皮西林210微克加入无菌的巴奇管中。

现在收集两毫升的隔夜生长培养，并转移到两毫升微型离心管。在10，000 RCF下离心90秒后，取出上经液，并在两毫升新鲜生长介质中重新暂停。然后将重新暂停的培养物加入含有8毫升新鲜生长介质和安西林的巴奇管中。

使用无菌技术，在从厌氧室中去除橡胶塞之前，小心地将其放在捆扎管上。然后将管子放入培养箱中，在37摄氏度下以220转/小时的速度摇晃。下午三到五.m。

将带培养物的捆扎管、新的无菌捆扎管和生长介质引入厌氧室。在无菌巴奇管中加入100微升的培养物，加入10毫升的新鲜生长介质，加入安皮西林。使用无菌技术，小心地将橡胶塞放在捆扎管上。

将管子从厌氧室中拆下，然后以 37 摄氏度的温度下在 220 rpm 下摇动过夜。第二天.m十点之间，将培养和生长介质转移到厌氧室。

再次添加八毫升的生长介质和安西林到无菌的捆扎管。将隔夜生长培养的两毫升培养成两毫升的微型离心管。离心后，像以前一样，去除上经剂，并在两毫升新鲜生长介质中重新暂停细胞。

然后将重新暂停的培养物添加到含有新鲜生长介质和安皮西林的捆扎管中。使用无菌技术，小心地将橡胶塞放在捆扎管上。将其从腔室中取下，并在 37 摄氏度下以 220 rpm 的转速振动而生长。

使用分光光度计监测培养量的生长，通过涡旋培养，然后以 600 纳米或 OD600 测量光密度。经过三到四个小时的预期增长后，该培养者应达到 OD600 的 6。现在将管放入厌氧室，并将培养培养器转移到两个两毫升微离心管中。

离心后，如前删除上一提液，并在两毫升新鲜暴露介质中重新暂停每个细胞味觉。重复此洗涤步骤一次，以去除生长介质的任何痕迹。现在，将细胞培养的两个微型离心管组合成一个七毫升PTFE标准小瓶，以获得用于暴露测定的生物传感器库存。

在开始实验之前，检查厌氧监测器，以确保厌氧室中没有氧气。根据 96 井模板设计板材布局。在三个技术复制中运行实验，将允许32种不同的处理，这是最好的代表与四由八网格设置小瓶。

根据检测板布局设置四八网格。然后将七毫升 PTFE 标准小瓶放在托盘中。小瓶只能通过操纵小瓶的外在来处理。

将暴露介质体积添加到每个与每种处理对应的瓶中。每个小瓶添加相应的化学变量体积，根据板布局进行测试。现在在每个小瓶中加入硝酸盐，使浓度为200微摩尔。

排除此步骤的组成生物传感器治疗空白。要向小瓶中加入汞，首先将四到八微摩尔库存并摇好。将溶液和暴露介质稀释在7毫升PTFE小瓶中，浓度为100至250纳米摩尔，以制造工作汞溶液。

根据此工作解决方案，根据板布局将汞添加到所需的小瓶中。加入汞或镉后，手动摇动板的轨道运动。实验现在可以暂停，这取决于汞或镉在溶液中指定所需时间。

恢复实验时，轻轻移液器生物传感器存量来回，以确保均匀性。然后将生物传感器库存的100微升添加到每个小瓶中，并像以前一样手动摇动板。将板读卡器预热至 37 摄氏度，并设置动能运行 10 小时，每 5 到 5 分钟读取一次。

在读数之间的轨道抖动。设置运行，以进行荧光测量，荧光激发为440纳米，发射500纳米。现在移液器200微升从每个PTFE小瓶在四由八格入相应的井的96井板。

在传输每个 200 微升之前，来回移位 5 次。不要丢弃移液器尖端，而是将移液器尖端留在 PTFE 小瓶中，以跟踪移液进度。将 96 井板放入板读卡器的托盘中。

然后将盖子放在 96 井板上，然后开始检测。以下是具有代表性的结果显示校正荧光数据是时间函数。氟化表现为汞对可感知生物传感器的浓度增加。

所有值都为无汞控制值的空白。荧光峰可以量化，以显示荧光信号作为汞或镉浓度的函数。对于可感知和组成生物传感器，应使用可引物传感器中间的汞或镉浓度线性范围进行测试变量。

以下是锌无定论结果的示例。镁和锰对生物传感器的汞生物利用度有一个结论性结果。锌的结果没有结论，因为构成荧光衰变与不可吸收的荧光指示毒性。

在尝试此程序时，必须记住输入镉或汞的浓度，因为这些浓度将用于校准生物传感器。按照此过程，可以执行其他方法，如水系统的热力学建模，以回答其他问题，如汞或镉的特定化学种类如何影响其生物利用度。不要忘记，使用镉、汞和硫酸等强酸可能非常危险，在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护设备。

该技术开发后，为环境微生物领域的研究人员探索准实时厌氧汞或镉生物利用度和基因可治疗微生物铺平了道路。