Genetics
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संवर्धन और हेरफेर के O9-1 तंत्रिका शिखा कोशिकाओं
Summary October 9th, 2018
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O9-1 एक multipotent माउस तंत्रिका शिखा सेल लाइन है । यहाँ हम संवर्धन O9-1 कोशिकाओं के लिए विस्तृत कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन, विशिष्ट कोशिका प्रकार में O9-1 कोशिकाओं में अंतर, और आनुवंशिक रूप से सिरना-मध्यस्थता पछाड़ना या CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन का उपयोग करके O9-1 कोशिकाओं को जोड़ तोड़.
Transcript
O9-1 सेल लाइन विट्रो में तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है। यह अनुसंधान के विभिन्न उपयोग में आवेदन की एक विस्तृत श्रृंखला में उपयोग के लिए एक महान क्षमता है। O9-1 कोशिकाओं के स्पष्ट फायदे होते हैं, जैसे आसान पहुंच, और जल्दी से प्रयोगों के लिए पर्याप्त सेल नंबर प्राप्त करना, जिससे यह तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं के इन विट्रो अध्ययनों के लिए एक शक्तिशाली विधि मानार्थ हो जाता है।
शुरू करने के लिए, पाठ प्रोटोकॉल के अनुसार, O9-1 सेल संस्कृति के लिए बेसल मीडिया तैयार करें। फिर, बेसल मीडिया को फ़िल्टर करें, और इसे प्रकाश से बचाने के लिए पन्नी में लपेटें। इसके बाद, टेक्स्ट प्रोटोकॉल के अनुसार सक्रिय एसटीओ कोशिकाओं से वातानुकूलित बेसल मीडिया एकत्र करें।
सबसे पहले, दो घंटे के लिए बर्फ पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के एक aliquot गल । फिर, 0.5 मिलीग्राम/मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए 10% एफबीएस के साथ फ़िल्टर किए गए निष्फल डीएमईएम के साथ तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को पतला करें। एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ थाली कोट।
फिर, प्लेट को झुकाते समय बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स को एस्पिरेट करें। प्लेटों को 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सुखा लें। प्लेट में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को जोड़ते समय, सुनिश्चित करें कि समाधान सेल विशेषताओं को बनाए रखने और प्रयोगों के बीच अनावश्यक भिन्नता से बचने के लिए अच्छी तरह से समान रूप से कवर किया गया है।
37 डिग्री सेल्सियस पानी-स्नान में क्रायो-शीशी रखकर O9-1 कोशिकाओं को ठीक करें। धीरे-धीरे शीशी को तब तक घूमता है जब तक कि समाधान पूरी तरह से तरल नहीं हो जाता है। इसके बाद, क्रायो-शीशी से सेल समाधान को 15 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए ट्यूब में 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम के पांच खंड जोड़ें। 180 जीएस पर तीन मिनट के लिए कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें, सुपरनेट को एस्पिरेट करें, इस बात का ध्यान रखें कि गोली को परेशान न करें। इसके बाद, एलआईएफ और बीएफजीएफ के साथ पूरक वातानुकूलित बेसल मीडिया में गोली को फिर से निलंबित करें।
कोशिकाओं को छह अच्छी तरह से प्लेट में बीज करें, और कोशिकाओं को समान रूप से बीज करने के लिए प्लेट को उत्तेजित करें। प्लेट को उत्तेजित करते समय, क्षैतिज और खड़ी रूप से ऐसा करें, क्योंकि प्लेट को घूमता रहने से कोशिकाएं केंद्र की ओर ध्यान केंद्रित करेंगी। और उन कोशिकाओं को रातोंरात एक मानक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में संलग्न और बढ़ने की अनुमति दें।
सुनिश्चित करें कि मीडिया को बदलने से पहले कोशिकाएं जुड़ी हुई हैं। जब O9-1 कोशिकाओं 80% संकुचन तक पहुँचने, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स गल और एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित प्लेट तैयार के रूप में पहले वर्णित है। फिर झिल्ली मैट्रिक्स में एलआईएफ और बीएफजीएफ के साथ पूरक बेसल मीडिया जोड़ें।
धीरे-धीरे दो बार डीपीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ कुओं को कुल्ला। फिर, कोशिकाओं को 0.05% ट्राइप्सिन ईडीटीए के 1 मिलीलीटर के साथ तीन मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अलग करें। कुएं की पूरी सतह पर तरल को बार-बार पाइप करके 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम की समान मात्रा के साथ ट्राइप्सिन को बेअसर करें।
इसके बाद सेल सॉल्यूशन को सेंट्रलाइज ट्यूब में ट्रांसफर कर लें। और १८० जीएस पर तीन मिनट के लिए अपकेंद्रित्र कोशिकाओं के गोली परेशान किए बिना सुपरनेट को Aspirate । इसके बाद, एलआईएफ और बीएफजीएफ के साथ पूरक वातानुकूलित बेसल मीडिया को धीरे-धीरे पिपेटिंग करके सेल पेलेट को फिर से रीसस्ट करें।
पहले वर्णित लेपित प्लेट में कोशिकाओं को बीज करें। फिर, कोशिकाओं को एक मानक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में संलग्न और बढ़ने की अनुमति दें। सबसे पहले टेक्स्ट प्रोटोकॉल के मुताबिक 2X फ्रीजिंग मीडिया तैयार करें।
इसके बाद मीडिया को फिल्टर-स्टरलाइज करें। दो बार डीपीबीएस के साथ प्लेट की दीवारों को कुल्लाएं, कोशिकाओं को खोने से बचने के लिए धीरे-धीरे पाइपिंग करें। अगला तीन मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.05% ट्राइप्सिन ईडीटीए के साथ कोशिकाओं को अलग करता है।
10% एफबीएस और डीएमईएम की समान राशि के साथ ट्राइपसिन को बेअसर करें। प्लेट की सामग्री को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 180 जीएस पर तीन मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें, सुपरनेट को एस्पिरेट करें और गोली को फिर से खर्च करने के लिए पीबीएस के 2 मिलीलीटर जोड़ें। सेल समाधान को एक बार और अधिक अपकेंद्री करें और सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें।
आवश्यकतानुसार ट्यूब में बेसल मीडिया की मात्रा को समायोजित करें, और 2X फ्रीजिंग मीडिया की बराबर राशि जोड़ें। इसके बाद, कोशिकाओं को लेबल किए गए क्रायो शीशियों में स्थानांतरित करें। कम से कम 24 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर धीमी ठंडक दर प्राप्त करने के लिए एक ढक्कन के साथ एक पॉलीस्टीरिन बॉक्स के अंदर क्रायो शीशियों रखें।
O9-1 कोशिकाओं में SIRNA नॉकडाउन प्रदर्शन करने के लिए, ठीक है और कोशिकाओं बीज । सीरम मुक्त मीडिया की एक उपयुक्त मात्रा में पतला लिपोसोम। फिर, पाठ प्रोटोकॉल के अनुसार सीरम मुक्त मीडिया में सिरना पतला।
इसके बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, पतला लिपोसोम में पतला सिरना जोड़ें। पिपटिंग द्वारा समाधान मिलाएं, और कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इसके बाद, कोशिकाओं में सिरना लिपिड कॉम्प्लेक्स की उचित मात्रा जोड़ें।
फिर, एक मानक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। O9-1 कोशिकाओं विशिष्ट भेदभाव संस्कृति की स्थिति के तहत विभिन्न सेल प्रकार में अंतर कर सकते हैं। ओ 9-1 कोशिकाओं को ऑस्टियोप्लास्ट में अंतर करने के लिए, टेक्स्ट प्रोटोकॉल के अनुसार ऑस्टियोजेनिक विभेदन मीडिया तैयार करें।
अंत में, इम्यूनो धुंधला द्वारा विभेदित ऑस्टियोप्लास्तास में ऑस्टियोप्लास्लास्ट मार्कर ऑस्टियोकैल्स्किन का पता लगाएं। O9-1 कोशिकाओं को चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में अंतर करने के लिए, पाठ प्रोटोकॉल के अनुसार भेदभाव मीडिया के तहत उन्हें संस्कृति, और चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन इम्यूनो धुंधला द्वारा भेदभाव का मूल्यांकन । इस प्रोटोकॉल में, O9-1 कोशिकाओं में कार्य के Yap नुकसान का अध्ययन करने के लिए दोनों नॉक आउट और नॉक आउट प्रयोग किए गए।
चिकनी मांसपेशी कोशिका भेदभाव की स्थिति के तहत, अधिकांश जंगली प्रकार O9-1 कोशिकाओं ने चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन सकारात्मक चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को जन्म दिया। Yap नल कोशिकाओं हालांकि आम तौर पर SMA सकारात्मक चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में अंतर करने में विफल रहा है । यह इंगित करता है कि Yap चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में तंत्रिका शिखा कोशिकाओं के भेदभाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ।
इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, पूरी प्रक्रिया के दौरान O9-1 सेल लाइन को धीरे और सावधानी से संभालना याद रखना महत्वपूर्ण है। बेसल झिल्ली मैट्रिक्स को ठीक से पतला और उपयोग करना सुनिश्चित करें, और सेल वियोजन के लिए 0.05% ट्राइप्सिन का उपयोग करें। यह न भूलें कि O9-1 सेल संस्कृति की तैयारी के दौरान, माइटोमाइसिन सी के साथ काम करना बेहद खतरनाक हो सकता है, और इस प्रक्रिया को निष्पादित करते समय प्रयोगशाला कोट और दस्ताने पहनने जैसी सावधानियां हमेशा ली जानी चाहिए।
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