Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kweken en manipulatie van O9-1 neurale kamcellen
Summary October 9th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
O9-1 is een cellijn van multipotente muis crest van de neurale. Hier beschrijven we gedetailleerde stapsgewijze protocollen voor kweken O9-1 cellen, O9-1 cellen in specifieke celtypes te differentiëren en genetisch manipuleren O9-1 cellen met behulp van siRNA-gemedieerde knockdown of bewerken van CRISPR-Cas9-genoom.
Transcript
De O9-1 cellijn is een zeer nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van neurale kuifcellen in vitro. Het heeft een groot potentieel voor gebruik in een breed scala van toepassingen in verschillende gebruik van onderzoek. O9-1 cellen hebben duidelijke voordelen, zoals gemakkelijke toegang, en snel het verkrijgen van voldoende celnummers voor experimenten, waardoor het een krachtige methode gratis voor in vitro studies van neurale kuifcellen.
Om te beginnen, bereid basale media voor O9-1 celcultuur, volgens het tekstprotocol. Vervolgens, filter de basale media, en wikkel het in folie om het te beschermen tegen het licht. Verzamel hierna geconditioneerde basale media uit een geactiveerde STO-cellen volgens het tekstprotocol.
Ten eerste, ontdooi een aliquot van kelder membraan matrix op ijs voor twee uur. Verdun vervolgens de keldermembraanmatrix met gefilterde gesteriliseerde DMEM met 10%FBS tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 mg/ml. Bedek de plaat met de keldermembraanmatrix op kamertemperatuur gedurende een uur.
Vervolgens, aspirate de kelder membraan matrix tijdens het kantelen van de plaat. Droog de platen op 30 graden Celsius gedurende 30 minuten. Bij het toevoegen van de kelder membraan matrix aan de plaat, zorg ervoor dat de oplossing bedekt de put gelijkmatig om celkenmerken te behouden en onnodige variatie tussen experimenten te voorkomen.
Herstel O9-1 cellen door het plaatsen van een cryo-flacon in een 37 graden Celsius water-bad. Draai de flacon langzaam tot de oplossing volledig in vloeistof verandert. Breng hierna de celoplossing van de cryo-flacon over naar een 15ml centrifugebuis.
Voeg vijf volumes DMEM met 10% FBS toe aan de buis om de cellen opnieuw op te schorten. Centrifugeer de cellen gedurende drie minuten op 180 Gs.Dan, aspirate de supernatent, oppassen niet te verstoren de pellet. Vervolgens opnieuw op te schorten de pellet in geconditioneerde basale media aangevuld met LIF en BFGF.
Zaad de cellen in een zes put plaat, en roer de plaat om de cellen gelijkmatig zaad. Bij het roeren van de plaat, doe dit horizontaal en verticaal, als wervelende de plaat zal leiden tot de cellen te concentreren in de richting van het centrum. En laat die cellen 's nachts hechten en groeien in een standaard celkweek incubator.
Zorg ervoor dat de cellen zijn bevestigd voordat u de media wijzigt. Wanneer de O9-1 cellen bereiken 80%confluency, ontdooien de kelder membraan matrix en bereiden een kelder membraan matrix gecoate plaat zoals eerder beschreven. Voeg vervolgens basale media aangevuld met LIF en BFGF toe aan de membraanmatrix.
Spoel de putten voorzichtig twee keer af met 2 ml DPBS. Vervolgens, dissociaci de cellen met 1ml van 0,05% trypsin EDTA op 37 graden Celsius gedurende drie minuten. Neutraliseer de trypsine met een gelijke hoeveelheid DMEM met 10%FBS door de vloeistof herhaaldelijk over het hele oppervlak van de put te pipetten.
Breng vervolgens de celoplossing over op een centrifugebuis. En centrifuge gedurende drie minuten op 180 Gs.Aspirate de supernatent zonder verstoring van de pellet van cellen. Vervolgens resuspend de cel pellet door voorzichtig pippetting geconditioneerde basale media aangevuld met LIF en BFGF.
Zaad de cellen op de gecoate plaat zoals eerder beschreven. Laat de cellen vervolgens hechten en groeien in een standaard celkweek incubator. Bereid eerst de 2X bevriezing media volgens het tekstprotocol.
Vervolgens filter-steriliseren van de media. Spoel de wanden van de plaat twee keer met DPBS, pipetter zachtjes om te voorkomen dat het verliezen van cellen. Vervolgens scheiden de cellen met 0,05% trypsin EDTA op 37 graden Celsius gedurende drie minuten.
Neutraliseer de trypsine met een gelijk bedrag van 10%FBS en DMEM. Breng de inhoud van de plaat naar een centrifugebuis en vercentrifugeer drie minuten bij 180 Gs.Aspirate vervolgens de supernatent en voeg 2 ml PBS toe om de pellet opnieuw te gebruiken. Centrifugeer de celoplossing nogmaals en aspirate de supernatent.
Pas de hoeveelheid basale media in de buis indien nodig, en voeg een gelijke hoeveelheid 2X bevriezing media. Breng vervolgens de cellen over naar de gelabelde cryo-flesjes. Plaats de cryo flacons in een polystyreendoos met een deksel om gedurende ten minste 24 uur een langzame koelsnelheid bij 80 graden Celsius te bereiken.
Als u SIRNA-knockdown wilt uitvoeren in O9-1-cellen, herstelt en zaait u de cellen. Verdun liposomen in een passend volume serumvrije media. Verdun SIRNA vervolgens in serumvrije media volgens het tekstprotocol.
Voeg hierna de verdunde SIRNA toe aan de verdunde liposomen, volgens de instructies van de fabrikant. Meng de oplossing door pipetting, en incubeer gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg vervolgens een passend volume SIRNA-lipidencomplex toe aan de cellen.
Vervolgens, incubeer de cellen voor 24 uur in een standaard cel cultuur incubator. O9-1 cellen kunnen zich onderscheiden in verschillende celtypen onder specifieke differentiatiecultuuromstandigheden. Om O9-1 cellen te differentiëren in osteoplasten, bereid osteogene differentiatiemedia volgens het tekstprotocol voor.
Tot slot, detecteer de osteoplast marker osteocalcine in gedifferentieerde osteoplasten door immuno vlekken. Om O9-1 cellen te differentiëren in gladde spiercellen, cultuur ze onder differentiatie media volgens het tekstprotocol, en evalueren van de differentiatie door glad-spier actin immuno kleuring. In dit protocol werden zowel knock-out als knock down experiment uitgevoerd om Yap-functieverlies in O9-1-cellen te bestuderen.
Onder gladde spiercel differentiatie voorwaarden, de meeste wilde type O9-1 cellen gaf aanleiding tot gladde spieractin positieve gladde spiercellen. Yap null cellen echter over het algemeen niet te onderscheiden in SMA positieve gladde spiercellen. Dit geeft aan dat Yap een cruciale rol speelt bij de differentiatie van neurale kuifcellen in gladde spiercellen.
Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de O9-1 cellijn voorzichtig en zorgvuldig te behandelen tijdens het hele proces. Zorg ervoor dat u de basale membraanmatrix goed verdunt en gebruikt en gebruik 0,05% trypsine voor celdissociatie. Vergeet niet dat tijdens de voorbereiding van O9-1 celcultuur, het werken met mitomycine c zeer gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van een labjas en handschoenen moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.
Related Videos
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
