Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Odling och manipulering av O9-1 Neural Crest celler
Summary October 9th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
O9-1 är en multipotenta mus neural crest cellinje. Här beskriver vi detaljerade stegvisa protokoll för odling O9-1 celler, differentiera O9-1 celler till specifika celltyper och genetiskt manipulera O9-1 celler med siRNA-medierad knockdown eller CRISPR-Cas9 gen editering.
Transcript
Den O9-1 cellinje är ett mycket användbart verktyg för att studera neurala crest celler in vitro. Det har en stor potential för användning i ett brett spektrum av tillämpning i olika användning av forskning. O9-1 celler har uppenbara fördelar, såsom enkel åtkomst, och snabbt få tillräckligt med cellnummer för experiment, vilket gör det till en kraftfull metod som är gratis att in vitro-studier av neurala crest celler.
Till att börja, förbereda basala medier för O9-1 cell kultur, enligt textprotokollet. Filtrera sedan basala medier, och linda in den i folie för att skydda den från ljuset. Efter detta samlar du in betingade basala medier från en aktiverad STO-celler enligt textprotokollet.
Först tina en alikvot av källaren membranmatris på is i två timmar. Späd sedan källaren membranmatris med filtrerade steriliserade DMEM med 10%FBS till en slutlig koncentration av 0.5mg/ml. Belägga plattan med källaren membranmatrisen i rumstemperatur i en timme.
Därefter aspirera källaren membranmatrisen medan du lutar plattan. Torka plattorna i 30 grader Celsius i 30 minuter. När du lägger källaren membran matrisen till plattan, se till att lösningen täckte väl jämnt för att upprätthålla cellens egenskaper och undvika onödig variation i mellan experiment.
Återvinna O9-1 celler genom att placera en kryo-injektionsflaska i en 37 grader Celsius vatten-bad. Snurra långsamt injektionsflaskan tills lösningen helt blir till vätska. Efter detta överför celllösningen från kryoflaskan till ett centrifugrör på 15 ml.
Lägg till fem volymer DMEM med 10%FBS till röret för att åter upphäva cellerna. Centrifugera cellerna i tre minuter vid 180 Gs.Därefter aspirera supernatent, var noga med att inte störa pelleten. Därefter åter upphäva pelleten i konditionerade basala medier kompletteras med LIF och BFGF.
Frö cellerna i en sex brunnsplatta, och agitera plattan för att så cellerna jämnt. När agiterar plattan, gör det horisontellt och vertikalt, som virvlande plattan kommer att orsaka cellerna att koncentrera sig mot centrum. Och låta dessa celler att fästa och växa i en vanlig cellkultur inkubator över natten.
Se till att cellerna är kopplade innan du byter media. När de O9-1 cellerna når 80%konfluency, tina källaren membran matris och förbereda en källare membran matris belagda platta som beskrivits tidigare. Lägg sedan till basal media kompletterat med LIF och BFGF till membranmatrisen.
Skölj försiktigt brunnarna med 2 ml DPBS två gånger. Därefter, dissociate cellerna med 1ml av 0.05%trypsin EDTA vid 37 grader Celsius i tre minuter. Neutralisera trypsin med en lika stor mängd DMEM med 10%FBS genom att upprepade gånger pipettering vätskan över hela ytan av brunnen.
Överför sedan celllösningen till ett centrifugrör. Och centrifugera i tre minuter vid 180 Gs.Aspirate supernatent utan att störa pelleten av celler. Därefter resuspend cell pelleten genom försiktigt pippetting betingade basala medier kompletteras med LIF och BFGF.
Utsäde cellerna till belagda plattan som tidigare beskrivits. Sedan, låt cellerna att fästa och växa i en vanlig cellkultur inkubator. Förbered först 2X-frysningsmediet enligt textprotokollet.
Sedan, filtrera-sterilisera media. Skölj väggarna i plattan med DPBS två gånger, pipettering försiktigt för att undvika att förlora celler. Nästa dissociate cellerna med 0.05%trypsin EDTA på 37 grader Celsius i tre minuter.
Neutralisera trypsin med en lika stor mängd 10%FBS och DMEM. Överför innehållet i plattan till ett centrifugrör, och centrifug i tre minuter vid 180 Gs.Därefter aspirera supernatent och tillsätt 2 ml PBS för att återanvända pelleten. Centrifugera celllösningen en gång till och aspirera supernatenten.
Justera mängden basalmedia i röret efter behov, och lägg till en lika stor mängd 2X frysningsmedia. Därefter överför du cellerna till de märkta kryo injektionsflaskan. Placera kryoflaskan inuti en polystyrenlåda med lock för att uppnå en långsam kylhastighet vid 80 grader Celsius i minst 24 timmar.
För att utföra SIRNA knockdown i O9-1 celler, återhämta sig och utsäde cellerna. Späd ut liposomer i en lämplig volym av serumfria medier. Späd sedan UT SIRNA i serumfria medier enligt textprotokollet.
Efter detta, tillsätt det utspädda SIRNA till de utspädda liposomerna, enligt tillverkarens anvisningar. Blanda lösningen genom pipettering, och inkubera i fem minuter i rumstemperatur. Därefter lägger du till en lämplig volym av SIRNA lipidkomplex till cellerna.
Sedan, inkubera cellerna i 24 timmar i en vanlig cellkultur inkubator. O9-1 celler kan differentiera sig till olika celltyper under specifika differentieringskulturförhållanden. För att differentiera O9-1-celler till osteoplaster, förbereda osteogen differentiering media enligt textprotokollet.
Slutligen, upptäcka osteoplast markören osteokalcin i differentierade osteoplaster genom immunfärgning. För att differentiera O9-1 celler till glatta muskelceller, kultur dem under differentiering media enligt textprotokollet, och utvärdera differentiering genom smooth-muscle aktin immunfärgning. I detta protokoll, både slå ut och slå ner experiment för att studera Yap förlust av funktion i O9-1 celler utfördes.
Under smooth muscle cell differentiering villkor, de flesta vilda typ O9-1 celler gav upphov till glatt muskel aktin positiva glatt muskelceller. Yap null celler dock i allmänhet misslyckats med att differentiera till SMA positiva glatt muskelceller. Detta indikerar att Yap spelar en avgörande roll i differentiering av neurala crest celler i glatta muskelceller.
Medan du försöker den här proceduren är det viktigt att komma ihåg att hantera O9-1-cellinjen försiktigt och försiktigt under hela processen. Se till att späda ut och använda basalmembranmatrisen ordentligt, och använd 0,05%trypsin för cellsdissociation. Glöm inte att under förberedelserna för O9-1 cell kultur, arbeta med mitomycin c kan vara extremt farligt, och försiktighetsåtgärder såsom bär en labbrock och handskar bör alltid vidtas medan du utför denna procedur.
Related Videos
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
