对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织样本进行免疫谱型分析已成为肿瘤免疫学研究中的关键组成部分，尤其在临床试验背景下，用于发现和验证癌症免疫治疗的新型预测性生物标志物1,2。使用化学显色剂（如二氨基联苯胺）的显色免疫组化（IHC）仍是病理诊断中对活检组织进行免疫标记的标准技术3。标准IHC也可用于癌症组织的免疫谱型分析，包括定量分析肿瘤相关淋巴细胞亚群以及评估免疫检查点分子（如程序性细胞死亡配体1（PD-L1））的表达水平4,5。然而，标准IHC存在局限性，即每张组织切片只能标记一种抗原。由于免疫谱型研究通常需要分析多个标志物的联合表达情况，若使用标准IHC，则需对多张组织切片分别染色，每张切片仅染一种标志物，因此在分析核心针活检等小组织样本时会受到显著限制。此外，标准IHC方法在评估由不同细胞群体共表达的标志物时也存在局限，例如PD-L1等免疫检查点标志物常在肿瘤相关巨噬细胞和癌细胞中均有表达。这一局限性已在病理学家使用标准单重IHC对多种细胞类型表达的IHC标志物进行定量分析时被报道6。开发在同一组织切片上使用多种颜色显色剂的多重显色免疫组化技术，是对传统单重IHC方法的重要改进7，但其仍受限于仅能标记少数几个标志物，并且在准确评估同一细胞群体中相同亚细胞区域表达的标志物时面临重要的技术挑战。

上述关于临床样本中组织可获得性的注意事项，以及多重显色免疫组化（IHC）技术的局限性，促使人们需要开发更先进的多重检测方法，以用于基于荧光标记并结合成像系统的肿瘤免疫学研究，该系统能够有效分离同一张切片上多种荧光染料的信号。其中一种技术基于酪胺信号放大法（tyramide signal amplification, TSA），结合多光谱显微成像，实现高效的颜色分离8。一种市售的基于TSA的试剂盒采用了专为多光谱成像优化的荧光染料8（见材料表）。该系统的一个关键优势在于，其可兼容那些已用于常规显色IHC并经过验证和优化的未标记一抗9,10,11。这不仅加快了优化过程，还为引入新靶点的方案优化和抗体组合调整提供了灵活性。此外，多重免疫荧光（mIF）TSA方法可适配市售的自动化IHC染色系统，从而实现从单重显色IHC向mIF的顺利过渡。

本文介绍了一种基于自动化多重免疫荧光TSA染色并结合多光谱扫描仪成像的免疫肿瘤学研究用多重免疫荧光（mIF）检测方案。任何具备文中所述仪器设备和试剂的实验室用户均可对该方案进行适配与修改。该方案包含六种针对癌瘤免疫谱型分析的一抗组合：PD-L1、PD-1、CD68（泛巨噬细胞标记物）、CD8（细胞毒性T细胞）、Ki-67以及AE1/AE3（泛细胞角蛋白，作为上皮标记物用于识别癌瘤细胞）。近期一项研究报道了通过以显色免疫组化（IHC）作为标准参照，对人工操作的TSA多重免疫荧光方案进行优化的过程12. 本文介绍的改进方法采用了一种市售的七色TSA试剂盒，并在自动化染色仪中进行了优化，将染色时间从3–5天显著缩短至14小时，同时提高了染色结果的一致性。除本文提供的详细主实验方案外，还包含 补充材料 部分包括 "液滴控制" 方法，一种用于评估新mIF panel的附加质量控制流程，以及针对优化、故障排除和开发新多重panel的技术说明，以帮助实验室用户建立并优化定制mIF panel的mIF TSA方法。