Automatisierte Multiplex Immunfluoreszenz Panel für Immuno-Onkologie-Studien auf Formalin fixiert Karzinom Gewebeproben

Immunoprofiling Analyse von Gewebeproben FFPE Tumor ist ein wesentlicher Bestandteil der Immuno-Onkologie-Studien, insbesondere für die Entdeckung und Validierung der neue Prädiktive Biomarker für Krebsimmuntherapie im Rahmen von klinischen Studien^{1 geworden. ,2}. Chromogene IHC mit chemischen Chromogens wie Diaminobenzidine, bleibt die Standardtechnik in der diagnostischen Pathologie für die Immunolabeling der Biopsie Gewebe³. Standard IHC einsetzbar auch für Krebs-Gewebe-Immunoprofiling, einschließlich die Quantifizierung der Subpopulationen von Tumor-assoziierten Lymphozyten und die Beurteilung der Ausdruck Niveaus von immun Prüfpunkten wie programmierten Zelle Tod Liganden 1 (PD-L1)^{4 ,5}. Standard IHC ist begrenzt, jedoch, dass nur ein Antigen pro Gewebe Abschnitt bezeichnet werden kann. Da Immunoprofiling Studien in der Regel die Analyse der kombinierten Ausdruck mehrere Markierungen erforderlich, erfordern den Einsatz von standard IHC würde die Färbung von mehreren Gewebeschnitten, die jeweils mit einer einzigen Markierung befleckt und, daher wäre wesentlich begrenzt für die Analyse von kleinen Gewebeproben wie Kern Nadel Biopsien. IHC Standardmethoden beschränken sich auch für die Bewertung von Markern, die coexpressed sind durch unterschiedliche Zellpopulationen, wie üblich mit immun Checkpoint Marker wie PD-L1, die durch Tumor-assoziierten Makrophagen und Krebszellen zum Ausdruck kommt. Diese Einschränkung wurde in, zum Beispiel die Verwendung von standard Monoplex IHC von Pathologen für die Quantitative Analyse eines IHC-Markers geäußerten unterschiedlichen Zelle Arten⁶berichtet. Die Entwicklung von multiplex chromogenen IHC-Techniken mit unterschiedlichen farbigen Chromogens auf die gleichen Gewebe Abschnitt stellt eine Weiterentwicklung gegenüber der standard IHC Monoplex-Methode,⁷ bleiben begrenzt durch die Immunolabeling von wenigen Marker und stellen auch eine wichtige technische Herausforderung für die ordnungsgemäße Bewertung der Marker in der gleichen subzelluläre Fächer die gleichen Zellpopulationen ausgedrückt.

Die genannten Vorbehalte bezüglich Gewebe Verfügbarkeit von klinischen Proben, als auch die Grenzen der multiplex chromogenen IHC Techniken, haben zu der Notwendigkeit, verbesserte Multiplex-Verfahren für Immuno-Onkologie-Studien auf der Grundlage entwickeln geführt. fluoreszierende Kennzeichnung in Verbindung mit imaging-Systemen, die effektiv die Signale von mehreren Fluorophore von derselben Folie trennen können. Eine solche Technik basiert auf Tyramide Signalverstärkung (TSA) in Kombination mit multispektralen Mikroskopie Imaging für effiziente Farbe Trennung⁸. Eine handelsübliche TSA-basierte Kit beschäftigt Fluorophore für multispektrale bildgebenden⁸ optimiert (siehe Tabelle der Materialien). Ein entscheidender Vorteil dieses Systems ist seine Kompatibilität mit den gleichen unbeschriftete primäre Antikörper, die bereits überprüft und optimiert für standard chromogenen IHC^9,10,11. Dies ermöglicht nicht nur die schnellere Optimierung, sondern auch die Flexibilität in der Optimierung und Panel Modifikationen unter Einbeziehung neuer Ziele. Darüber hinaus kann die Multiplex-Immunfluoreszenz (mIF) TSA Methode für kommerziell erhältliche automatisierte IHC Stainer Systemen, so dass für einen einfachen Transfer vom Monoplex optimiert werden chromogenen IHC, mIF.

Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine mIF-Panel für Immuno-Onkologie-Studien auf der Grundlage mIF TSA Färbung automatisiert und einen multispektralen Scanner für die Bildgebung verwendet. Dieses Protokoll kann angepasst und geändert von jedem Labor-Benutzer mit Zugriff auf die beschriebenen Instrumente und Reagenzien. Das Protokoll enthält eine Gruppe von sechs primäre Antikörper für die Immunoprofiling Karzinome: PD-L1, PD-1, CD68 (als Pan-Makrophagen Marker), CD8 (zytotoxische T Zellen), Ki-67 und AE1/AE3 (Pan-Cytokeratin, verwendet als eine epitheliale Marker zur Identifizierung von Karzinomzellen). Eine aktuelle Studie beschreibt die Optimierung eines manuellen TSA-mIF-Protokolls mit chromogenen IHC als Standardwerk, um das Multiplex¹²Färbung zu validieren. Die hier vorgestellte aktualisierte Methode wurde entwickelt durch mit einem handelsüblichen, sieben-Farb TSA-Kit in einem automatisierten Stainer, drastisch Verkürzung der Färbung von 3 – 5 Tagen, 14 h, während gleichzeitig die Konsistenz der Färbung optimiert. Neben der detaillierten wichtigsten Protokoll hier vorgestellten enthält einen Abschnitt, Zusatzmaterialien "Drop-Control"-Methode, eine zusätzliche Qualitätskontrolle, ein neues mIF-Panel sowie technische Hinweise für die Optimierung zu bewerten, Fehlerbehebung und Entwicklung von neuen Multiplex-Platten, den Labor-Benutzer einrichten und optimieren die mIF-TSA-Methode für benutzerdefinierte mIF Panels zu helfen.