Immunoprofiling análisis de muestras de tejido FFPE tumor se ha convertido en un componente esencial de los estudios de inmuno-Oncología, particularmente para el descubrimiento y validación de nuevos biomarcadores predictivos para la inmunoterapia del cáncer en el contexto de ensayos clínicos1 ,2. IHC cromogénica, utilizando químicos cromógenos como diaminobenzidina, sigue siendo la técnica estándar en patología diagnóstica de la inmunomarcación de biopsia del tejido3. IHC estándar puede usarse también para immunoprofiling de tejido de cáncer, incluyendo la cuantificación de subpoblaciones de linfocitos tumorales asociadas y la evaluación de los niveles de expresión de checkpoints inmunes como ligando de muerte celular programada 1 (PD-L1)4 ,5. IHC estándar es limitada, sin embargo, en sólo un antígeno puede ser etiquetado según la sección de tejido. Porque immunoprofiling estudios requieren típicamente el análisis de la expresión combinada de varios marcadores, el uso de IHC estándar requiere la tinción de múltiples secciones de tejido, cada uno manchado con un marcador único y por lo tanto, sería sustancialmente limitado para el análisis de muestras de tejido pequeñas tales como las biopsias de aguja de núcleo. Estándar métodos IHC también son limitados para la evaluación de marcadores que son coexpressed por poblaciones de diversas células, como sucede con los marcadores de control inmune como PD-L1, que es expresada por macrófagos asociados a tumor y las células cancerosas. Esta limitación se ha divulgado en, por ejemplo, el uso del estándar monoplex IHC por los patólogos para el análisis cuantitativo de un marcador IHC expresado por células diversos tipos6. El desarrollo de técnicas de IHQ cromogénicos múltiplexes empleando diversos cromógenos coloreados en el mismo tejido sección representa un adelanto sobre el método estándar de monoplex IHC,7 aunque siguen siendo limitados por la inmunomarcación de unos pocos marcadores y también presenta un importante desafío técnico para la adecuada evaluación de marcadores expresados en el mismo compartimientos subcelulares de las mismas poblaciones de células.
Las salvedades mencionadas en cuanto a la disponibilidad de tejido de las muestras clínicas, así como las limitaciones de las técnicas de IHQ cromogénicos multiplexores, han dado lugar a la necesidad de desarrollar mejores métodos multiplexores para estudios de inmuno-Oncología etiquetado fluorescente combinado con sistemas que efectivamente pueden separar las señales de múltiples fluoróforos de la misma diapositiva de imágenes. Una tal técnica se basa en la amplificación de la señal de la tyramide (TSA) combinada con la proyección de imagen multiespectral de la microscopia de color eficiente separación8. Un kit disponible comercialmente basados en TSA emplea fluoróforos optimizado para imágenes multiespectrales8 (véase Tabla de materiales). Una ventaja fundamental de este sistema es su compatibilidad con los mismos anticuerpos primarios sin etiqueta que ya validadas y optimizadas para el estándar cromogénico IHC9,10,11. Esto permite no sólo la optimización más rápida sino también la flexibilidad en las optimización y el panel de modificaciones incorporando nuevos objetivos. Además, el método TSA multiplex inmunofluorescencia (mIF) puede ser optimizado para comercios IHC stainer sistemas automatizados, lo que permite una transferencia sencilla de monoplex IHC cromogénico a FOMIN.
Aquí presentamos un protocolo para un panel de FOMIN para estudios de inmuno-Oncología basada en automatizado FOMIN TSA tinción y utiliza un escáner multiespectral para la proyección de imagen. Este protocolo puede ser adaptado y modificado por cualquier usuario con acceso a la instrumentación descrita y reactivos de laboratorio. El protocolo incluye un panel de seis anticuerpos primarios para la immunoprofiling de los carcinomas: PD-L1, PD-1, CD68 (como un marcador de pan-macrófago), CD8 (células T-citotóxicas), Ki-67 y AE1/AE3 (cacerola-cytokeratin, utilizado como marcador epitelial para la identificación de células del carcinoma). Un estudio reciente describe la optimización de un protocolo de FOMIN TSA manual utilizando IHC cromogénico como referencia estándar para validar el múltiplex tinción12. El método actualizado presentado aquí ha sido desarrollado por con el equipo de TSA comercialmente disponible, siete colores optimizado en un teñidor automático, drásticamente acortando el tiempo de tinción de 3 – 5 días a 14 h, mejorando también la consistencia de la tinción. Además del protocolo principal detallado presentado aquí, una sección de Materiales complementarios incluye el método de "control de la gota", un proceso de control de calidad adicional para evaluar un nuevo panel de FOMIN, así como notas técnicas para la optimización, solución de problemas y desarrollo de nuevos paneles múltiplexes para ayudar al usuario del laboratorio para configurar y optimizar el método TSA de mIF FOMIN personalizados paneles.