Automated panneau Multiplex Immunofluorescence pour des études sur des échantillons de tissus fixés au formol carcinome Immuno-oncologie

Immunoprofiling analyse des échantillons de tissu de tumeur FFPE est devenue une composante essentielle des études immuno-oncologie, en particulier pour la découverte et la validation de nouveaux biomarqueurs prédictifs pour l’immunothérapie contre le cancer dans le cadre d’essais cliniques^{1 ,2}. Épreuve à développement chromogène IHC, aide chimiques chromogènes tels que diaminobenzidine, reste la technique standard en pathologie diagnostique pour l’immunomarquage de biopsie tissulaire³. IHC standard peut également être utilisé pour le cancer des tissus immunoprofiling, y compris la quantification des sous-populations de lymphocytes associées à la tumeur et l’évaluation des niveaux d’expression de points de contrôle immunitaires comme ligand de mort cellulaire programmée 1 (PD-L1)^{4 ,},⁵. IHC standard est limitée, cependant, en ce que qu’un seul antigène peut être étiqueté par section de tissu. Parce que les études d’immunoprofiling exigent généralement l’analyse de l’expression combinée de plusieurs marqueurs, l’utilisation de l’IHC standard nécessiterait la coloration des coupes de tissus multiples, chacun colorées avec un seul marqueur et, par conséquent, serait considérablement limité pour l’analyse des échantillons de tissus petit comme les biopsies à l’aiguille centrale. Méthodes IHC standard sont aussi limitées pour l’évaluation des marqueurs qui sont co-exprimés par les populations de diverses cellules, comme c’est souvent avec des marqueurs de point de contrôle immunitaire tels que PD-L1, qui s’exprime par les macrophages associées à la tumeur et les cellules cancéreuses. Cette limitation a été signalée dans, par exemple, l’utilisation du standard monoplex IHC de pathologistes pour l’analyse quantitative d’un marqueur d’IHC exprimée par diverses cellules types⁶. Le développement de multiplex chromogène IHC techniques employant divers chromogènes colorées sur le même tissu section représente un développement ultérieur au cours de la méthode standard de monoplex IHC,⁷ bien qu’ils restent limités par l’immunomarquage de peu marqueurs et présentent également un défi technique important pour une évaluation appropriée des marqueurs exprimés dans les compartiments subcellulaires mêmes des mêmes populations cellulaires.

Les mises en garde susmentionnées concernant la disponibilité de tissus d’échantillons cliniques, ainsi que les limites des techniques IHC chromogène multiplexes, ont donné lieu à la nécessité d’élaborer des méthodes améliorées de multiplexes pour les études immuno-oncologie basées sur marquage fluorescent combinée avec les systèmes qui peuvent effectivement séparer les signaux des fluorophores multiples de la même lame d’imagerie. Une telle technique est basée sur l’amplification de signal de tyramide (TSA) combinée avec l’imagerie multispectrale microscopie pour couleur efficace séparation⁸. Un kit disponible dans le commerce axée sur les TSA emploie fluorophores optimisés pour imagerie multispectrale⁸ (voir la Table des matières). Un avantage essentiel de ce système est sa compatibilité avec les mêmes anticorps primaires non étiquetés qui ont déjà été validés et optimisé pour la norme chromogène IHC^9,10,11. Cela permet non seulement une optimisation plus rapide, mais aussi souplesse dans les modifications d’optimisation et panneau incorporant de nouvelles cibles. En outre, la méthode TSA multiplex immunofluorescence (mIF) peut être optimisée pour commercialement disponible IHC stainer des systèmes automatisés, afin de permettre un transfert simple de monoplex IHC chromogène au mIF.

Nous présentons ici un protocole pour un tableau de mIF pour les études immuno-oncologie basée sur automatisé mIF TSA coloration et utilise un scanner multispectral pour l’imagerie. Ce protocole peut être adapté et modifié par n’importe quel utilisateur de laboratoire ayant accès à des instruments décrits et les réactifs. Le protocole inclut un panel de six anticorps primaires pour l’immunoprofiling des carcinomes : PD-L1, PD-1, CD68 (comme un marqueur de pan-macrophage), CD8 (cellules T cytotoxiques), Ki-67 et AE1/AE3 (pan-cytokératine, utilisé comme un marqueur épithélial pour l’identification des cellules de carcinome). Une étude récente décrit l’optimisation d’un protocole de mIF TSA manuelle en utilisant IHC chromogène comme un standard de référence pour valider le multiplex¹²de coloration. La méthode de mise à jour présentée ici a été développée en utilisant un kit TSA commercialement disponible, sept couleurs optimisé dans une passoire automatisé, raccourcir considérablement le temps de coloration de 3 à 5 jours à 14 h, tout en améliorant la cohérence de la coloration. Outre le protocole principal détaillé présenté ici, une section de Matériaux supplémentaires comprend la méthode « goutte-control », un processus de contrôle de qualité supplémentaire pour évaluer un nouveau panneau de mIF, ainsi que des notes techniques pour l’optimisation, dépannage et le développement de nouveaux panneaux multiplex pour aider l’utilisateur de laboratoire mis en place et optimiser le procédé TSA mIF de mIF personnalisés panneaux.